[发明专利]一种重组胡萝卜抗冻蛋白基因CaAFP及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种重组胡萝卜抗冻蛋白基因CaAFP及其应用，属于食品生物技术领域。

背景技术

胡萝卜抗冻蛋白是指在胡萝卜中具有冷诱导特性的抗冻蛋白。其热滞活性较低，但含有多个亲水性冰晶结合域，具有较强的抑制冰晶重结晶的能力。对胡萝卜的低温冻害有很强的保护作用。

胡萝卜抗冻蛋白发现的较早，本身的特性研究的较为透彻，具有较强的抑制重结晶能力，应用范围很广。但是作为植物抗冻蛋白的一种，依然存在着制备困难的问题。依靠提取的方法从胡萝卜中获取抗冻蛋白，工作量大，过程复杂，成本高，得率却很低，且难以获得单一的胡萝卜抗冻蛋白。

基因工程的成熟运用为大量制备胡萝卜重组抗冻蛋白提供了新的方法。通过将胡萝卜中编码抗冻蛋白的基因进行异源表达，然后利用微生物发酵的方法可以实现简单地大量制备胡萝卜重组抗冻蛋白。目前，将胡萝卜抗冻蛋白进行重组表达的研究已有报道，但集中在将胡萝卜基因组中编码抗冻蛋白的原基因在大肠杆菌中进行异源表达。Dang-Quan Zhang等在《Expression,purification,and antifreeze activity ofcarrot antifreeze protein and its mutants》利用胡萝卜基因组中编码抗冻蛋白的基因分别构建质粒pET11a-DcAFP-N130Q和pET11a-DcAFP-N130V并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了表达，得到了热值活性为0.35℃(1mg/mL)的重组抗冻蛋白。但是，抗冻蛋白在大肠杆菌内往往不能被正确的加工而形成有活性的抗冻蛋白，且用大肠杆菌表达的蛋白以包涵体的形式存在，这样对后续的分析工作十分困难。且由于大肠杆菌表达的蛋白为胞内蛋白，破碎细胞导致胞内蛋白释放，给目标蛋白的纯化带来很大的困难。

巴斯德毕赤酵母表达系统既有原核生物分子基因操作与生长的特征，又具备真核生物翻译后蛋自修饰的亚细胞机制。由于巴斯德毕赤酵母自身分泌的蛋白非常少，培养基中也不含其他的蛋白质，这样分泌的外源蛋白占培养液中总蛋白的绝大部分，因此十分有利于外源蛋白的分离和纯化。Jun Hyuck Lee等根据酵母抗冻蛋白的氨基酸序列，利用最有密码子的原则，翻译出最适的编码重组抗冻蛋白的基因LeIBP并构建质粒pPICZαA-LeIBP，导入毕赤酵母GS115中，发酵液中抗冻蛋白的含量为272mg/L，热值活性为0.4℃，抗冻蛋白热滞活性提升较少。

因此，实现胡萝卜抗冻蛋白在在毕赤酵母中表达，大量制备胡萝卜重组抗冻蛋白，提高胡萝卜抗冻蛋白的热滞活性和重结晶抑制活性，简便高效的提取工艺是亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种胡萝卜抗冻蛋白的基因工程菌，所述基因工程菌是以巴斯德毕赤酵母为宿主，表达来源于胡萝卜的抗冻蛋白。

在本发明的一种实施例中，所述胡萝卜的抗冻蛋白的基因CaAFP如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第二个目的是提供一种所述基因工程菌的构建方法是：将氨基酸序列为SEQ ID NO.1的抗冻蛋白基因连接到表达载体pPIC9K上，线性化后转化到巴斯德毕赤酵母中，筛选正确的转化子，得到基因工程菌。

本发明的第三个目的是提供一种所述基因工程菌的构建方法是提供一种所述基因工程菌发酵生产抗冻蛋白的方法，具体发酵方法如下：

(1)将基因工程菌在YPD固体平板上进行划线活化，活化的条件是：温度28℃-32℃，时间24-48h；

(2)挑取单菌落，接种至50mL BMGY液体培养基，在转速为150-250rpm，温度25-32℃条件下培养至OD为0.8-2.0，2500-5000×g离心2-8min离心收集菌体；

(3)用80-150mLBMMY液体培养基重新悬浮细胞，在150-250rpm，25-32℃的条件下开始诱导发酵培养；

(4)诱导发酵开始后，每8-16h向发酵液中加入甲醇维持诱导，至发酵液中甲醇的终浓度为0.5-2％(v/v)。诱导发酵。发酵结束后，5000-10000×g离心10min-30min，收集上清液。