[发明专利]一种重组胡萝卜抗冻蛋白基因CaAFP及其应用

权利要求书

1.一种胡萝卜抗冻蛋白的突变体，其特征在于，所述突变体是由核苷酸序列如(a)或(b)的基因编码得到的：

(a)SEQ ID NO.01；

(b)在严格条件下与(a)限定的核苷酸序列杂交且编码具有热滞活性和重结晶抑制活性的蛋白质核苷酸序列。

2.权利要求1所述突变体的氨基酸序列。

3.表达权利要求1所述突变体的基因工程菌。

4.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，以毕赤酵母为宿主。

5.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，构建方法是：将氨基酸序列为SEQ ID NO.1的抗冻蛋白基因连接到表达载体pPIC9K上，线性化后转化到巴斯德毕赤酵母中，筛选正确的转化子，得到基因工程菌。

6.应用根据权利要求3-5任一所述的基因工程菌生产胡萝卜抗冻蛋白突变体的发酵方法，其特征在于，所述方法步骤为：

(1)将基因工程菌在YPD固体平板上进行划线活化，活化的条件是：温度28℃-32℃，时间24-48h；

(2)挑取单菌落，接种至50mL BMGY液体培养基，在转速为150-250rpm，温度25-32℃条件下培养至OD为0.8-2.0，2500-5000×g离心2-8min离心收集菌体；

(3)用80-150mLBMMY液体培养基重新悬浮细胞，在150-250rpm，25-32℃的条件下开始诱导发酵培养；

(4)诱导发酵开始后，每8-16h向发酵液中加入甲醇维持诱导，至发酵液中甲醇的终浓度为0.5-2％(v/v)。诱导发酵。发酵结束后，5000-10000×g离心10min-30min，收集上清液；

(5)分离纯化。

7.根据权利要求6所述的发酵方法，其特征在于，所述步骤(5)的分离纯化的步骤为：

(1)用截留分子量为1k-3k的透析膜对得到的上清液进行脱盐处理；

(2)然后将截留液进行硫酸铵沉淀，饱和度为70％-90％，2℃-7℃静置2min-90min，7000-10000×g离心20min-30min得到粗蛋白质样品；

(3)用去离子水溶解粗蛋白质样品，然后采用RP-HPLC(Delta-Pak C18，3.9×150mm)柱梯度洗脱，洗脱液为体积分数10％-60％(含体积分数为0.1％的三氟乙酸)的乙腈，收集具有热值活性的洗脱峰，然后用截留分子量为1k-3k的透析膜透析32h-60h，冻干，获得抗冻蛋白纯品。

8.根据权利要求6所述的发酵方法，其特征在于，所述BMGY液体培养基组分为：蛋白胨15-25g/L，酵母提取物7-13g/L，无氨基酸的酵母氮源10-15g/L，生物素0.3-0.5g/L，100mL/L 1M磷酸盐缓冲液(pH 6.0)，10mL/L甘油。

9.根据权利要求7或8所述发酵方法得到的胡萝卜抗冻蛋白。

10.权利要求9所述胡萝卜抗冻蛋白在在冷冻面团、冰激凌制作中的应用。