[发明专利]RAA荧光法检测布鲁氏杆菌的探针及试剂盒

说明书

本发明公开一种检测布鲁氏杆菌RAA荧光法检测试剂盒，检测试剂盒包括以下组分：RAA基础荧光通用反应试剂、反应缓冲液、探针与引物混合物、阴性质控品、阳性质控品及临界阳性质控品。所述探针为5’端序列/荧光报告基团//idSp//淬灭基团/3’端序列；本试剂盒可直接对布鲁氏杆菌DNA检测，尤其可用于检测布鲁氏杆菌DNA含量较低的样品；本试剂盒在30－42℃下进行等温扩增检测，5－20min完成检测。试剂盒操作简单，配合小型仪器、携带方便，具有快速、灵敏、准确、重复性好的优点；适合基层和现场检测，具的良好的应用前景。

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域，具体涉及一种检测布鲁氏杆菌RAA荧光法检测的探 针、引物和试剂盒。

背景技术

布鲁氏杆菌病(brucellosis)简称布病，亦称“地中海热”、“马耳他热”、“波伏热”等，是 由一种布鲁氏杆菌(Brucella)感染牛、羊、猪等家畜，通过呼吸道、消化道、皮肤及生殖系 统等引起的人畜共患高度传染病。

布鲁氏杆菌是一种革兰氏阴性菌，其特点是不运动，几乎无荚膜(光滑型有微荚膜)，嗜 氧菌，氧化酶、触酶阳性，可还原硝酸盐，细胞内寄生，能在家畜体内存活。它一共包括六 种：牛型布鲁氏杆菌(流产布鲁氏杆菌)、羊型布鲁氏杆菌(马耳他布鲁氏杆菌)、猪布鲁氏 杆菌、狗布鲁氏杆菌、林鼠布鲁氏杆菌和绵羊布鲁氏杆菌等。布病主要发病于中东，非洲， 拉丁美洲，中亚和地中海周边几个地区，全球布鲁氏杆菌病患者已达50万左右，其疫情日趋 严重，从牧区、半牧区传播至农区甚至向城市蔓延的趋势。本菌侵入人体后，随淋巴液到达 淋巴结，被吞噬细胞吞噬，如布菌未被吞噬细胞杀灭，则细菌在胞内生长繁殖，形成局部原 发病灶。此阶段有人称为淋巴源性迁徙阶段，相当于潜伏期，潜伏期为7-60天，平均两周， 少数患者可达数月或1年以上。细菌在吞噬细胞内大量繁殖导致吞噬细胞破裂，随之大量细 菌进入淋巴液和血循环形成菌血症。在血液里细菌又被血流中的吞噬细胞吞噬，并随血流带 至全身，在肝、脾、淋巴结、骨髓等处的单核—吞噬细胞系统内繁殖，形成多发性病灶，造 成临床上不仅有菌血症、败血症，而且还有毒血症的表现。经一定时期后，感染灶的细菌生 长繁殖再次入血，导致疾病复发。组织病理损伤广泛。临床表现也就多样化。如此反复成为 慢性感染，慢性期多侵及脊柱和大关节，表现为长期发热(包括低热)、多汗、关节痛兼或肝、 脾、淋巴结和睾丸肿大等可疑症状及体征。上个世纪我国经历两次大流行后疫情开始有了下 降趋势，但本世纪初，疫情又有回升势头。到2007年初，已有25个省市自治区发现人间和 畜间布鲁氏杆菌病。据统计我国受布鲁氏杆菌感染潜在风险的人数达3.5亿，每年新发病例 数约3万人。布病是我国近年来发病人数增长迅速的传染病之一。目前《中华人民共和国传 染病防治法》已经把布鲁氏杆菌病归类为乙类传染病，与我们更为熟悉的“非典”、“猪流感”、 “炭疽”、“艾滋病”、“狂犬病”、“乙肝”等同属一类传染病。

美国疾病控制中心(center for disease control，CDC)因此也认为它可以制成生化武器， 并将其定义为“B类生物恐怖主义药剂”。由此可见布病具有巨大潜在威胁人们的身体健康， 它是一个严重的公共卫生问题，并引发严重的经济损失和较高的全球健康负担，预防布病传 播成为我国和全球共同使命。

目前，布鲁氏杆菌的传统检测技术主要包括病原分离技术、培养特性鉴定技术、血清学 检测技术、免疫学学检测技术及分子生物学等技术。

布鲁氏杆菌病病原学检测是从感染的血液或组织中分离培养布鲁氏杆菌，利用固体培养基 如血清葡萄糖琼脂、胰蛋白胨大豆琼脂培养基进行培养，检测原理是通过布鲁氏杆菌的菌体 形态、染色特征、菌落形态、生长特性、生化反应特点以及布鲁氏杆菌多克隆抗体凝集试验 等方法进行鉴别。此方法法是布鲁氏杆菌病诊断的“金标准”，其成本较低，具有定性和定量 分析特点。但同时存在分离率比较低、容易污染、耗时较长等问题，且分离布鲁氏杆菌对环 境和工作人员存在生物安全风险，因而限制了该方法的使用。

血清检查是医学上常用的一种检测手段，包括各种凝集反应、补体结合反应、沉淀反应 等。