[发明专利]14种高危型人乳头状瘤病毒E6/E7区mRNA检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及基因领域，具体是一种对14种高危型HPV E6/E7 mRNA检测试剂盒。

背景技术

人乳头状瘤病毒（human papillomavirus，HPV）自20世纪70年代末到20世纪80年代初发现与宫颈癌相关以来，一直受人们的关注。大量的研究结果表明：HPV在宫颈细胞异常以及宫颈癌的病理学上具有最为重要的作用。对宫颈癌组织标本的研究发现，99%以上的宫颈癌存在HPV感染。高危型HPV的持续感染是宫颈癌及其癌前病变发生发展的必要条件。在感染的潜伏期或宫颈癌前病变阶段检测出高危型HPV并采取适当的治疗措施，可以有效地阻断宫颈癌的发生。早期筛查、诊断和治疗癌前病变及宫颈癌是目前降低宫颈癌发病率和死亡率的关键。

目前，100多种HPV基因型已被鉴定，其中约40种与生殖道感染相关。高危型主要与宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）Ⅱ、Ⅲ级和宫颈癌的发生相关，其已明确有14种包括HPVl6、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68型。低危型一般与恶性病变无关，主要引起尖锐湿疣和低级别CIN（CINⅠ）。高危型HPV检测已经被推荐单独或联合细胞学应用于宫颈癌筛查。

美国及欧洲多所权威科研机构及大学研究证实E6/E7 mRNA水平与病变的严重程度相关。HPV E6/E7 mRNA在宫颈组织中表现癌基因活性。E6/E7致癌蛋白是细胞恶性转化的主要原因，一旦HPV整合进入人的基因组，E6/E7 mRNA的表达将不受限制，将增加到一个引起恶性转化的水平。欧洲权威专家评论文章报道高危型HPV E6/E7 mRNA的表达与病变严重程度的相关性检测在灵敏度方面与HPV DNA检测差不多，但在特异性方面却优于HPV DNA检测。因此，开发14种高危型HPV E6/E7 mRNA检测试剂盒对于宫颈癌的早期诊断、控制发展及预后监测有着极其重大的意义。

由于HPV无法在体外细胞培养，且不能诱导易于检测的免疫反应，所以不能采用血清学的方法进行HPV的检测，HPV的准确确定依赖于分子生物学技术。形态学以及临床观察仅仅对于HPV的存在提供一些推断性支持。

目前国内外对HPV进行检测的方法主要集中在以靶序列扩增为基础的检测和以信号放大为基础的检测技术两方面。

如注册号为国食药监械(进)字2014第3402263号产品“人乳头状瘤病毒检测试剂盒(捕获杂交法)”，因联合检测试剂盒”，该产品用于定性检测源自宫颈样本中14种型别的人乳头状瘤病毒(HPV)的E6/E7病毒信使RNA (mRNA)，但不区分具体型别。14种型别包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68型。注册号为国食药监械(进)字2014第3402263号产品“人乳头状瘤病毒16/18/45基因型检测试剂盒(捕获杂交法)” 该产品用于定性检测源自宫颈样本中人乳头状瘤病毒(HPV)16，18和45亚型的E6/E7病毒信使RNA (mRNA)，但不区分18和45亚型。

目前，临床上还没有能够基于多重荧光PCR技术，通过实时荧光PCR仪，进行一步法RT-PCR核酸扩增与检测出HPV E6/E7 mRNA的产品。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述问题，提供一种14种高危型人乳头状瘤病毒E6/E7区mRNA检测试剂盒，该试剂盒可应用于多重荧光PCR技术，对一般样本的14种高危型人乳头状瘤病毒初筛检测，其操作简便、结果客观准确。

本发明的第二个目的在于提供一种14种高危型人乳头状瘤病毒E6/E7区mRNA检测方法，该方法可在同一反应管中通过仪器两种荧光检测通道分别检测14种高危型HPV 的E6/E7区mRNA及细胞内对照β2微球蛋白mRNA的的试剂盒。细胞内对照β2微球蛋白mRNA用于评估样本质量及PCR抑制因素。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种14种高危型人乳头状瘤病毒E6/E7区mRNA检测试剂盒，包括：

（1）用于检测E6/E7区mRNA序列的一组TaqMan水解探针，序列为SEQ ID NO.1-7；

（2）用于特异性扩增E6/E7区mRNA序列的一组RT-PCR的引物，序列为SEQ ID NO.8-36。