[发明专利]14种高危型人乳头状瘤病毒E6/E7区mRNA检测试剂盒

权利要求书

1.一种14种高危型人乳头状瘤病毒E6/E7区mRNA检测试剂盒，包括：

（1）用于检测E6/E7区mRNA序列的一组TaqMan水解探针，序列为SEQ ID NO.1-7；

（2）用于特异性扩增E6/E7区mRNA序列的一组RT-PCR的引物，序列为SEQ ID NO.8-36。

2. 根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于, 所述用于检测14种高危型人乳头状瘤病毒E6/E7区mRNA的TaqMan水解探针为SEQ ID NO.1-6，其5’端标记荧光基团FAM,其3’端标记淬灭荧光基团BHQ1；

所述用于检测细胞内对照β2微球蛋白mRNAmRNA的TaqMan水解探针为SEQ ID NO.7，其5’端标记荧光基团HEX/JOE，其3’端标记淬灭荧光基团BHQ1。

3.一种用PCR-荧光探针法检测14种高危型人乳头状瘤病毒E6/E7区mRNA检测的方法，包括以下步骤：

提取样本RNA；

用DNase Ⅰ消化步骤（1）中提取的RNA中的DNA；

以步骤（2）中得到的RNA为模板，利用SEQ ID NO.8-36所述的引物进行特异性扩增E6/E7区mRNA及细胞内对照β2微球蛋白mRNA，得到PCR产物；

以SEQ ID NO.1-7所述的TaqMan水解探针，与步骤（3）所述PCR产物杂交，以达到设定阈值时所需的循环次数Ct值作为结果判断的标准；

Ct≤37：阳性；

37<Ct<45：可疑；取样本重新进行RNA提取和PCR检测，如重测结果Ct≤37，则判定为阳性；如重测结果Ct>37或无Ct值，则判定为阴性；

Ct>45或为0, 其内对照B2M在HEX荧光检测通道Ct值≤37：阴性；

样本在各荧光检测通道Ct值显示为Undet，判断为无效，重新采样；

所述PCR扩增的反应体系为：25µl反应体系含1×Reaction Mix （10mM Tris-HCl，0.2mM dNTP，3mM MgSO₄）,5.5mM MgSO₄，5.6µM扩增引物，1.4µM的水解探针，2.5U Taq酶，5µlDNA模板；

所述PCR扩增的反应条件为：50℃逆转录15min， 95°C热启动2min，95℃变性15 sec、60°C退火60 sec，共45个循环，最后一步38°C保存30sec；

PCR扩增时使用7500 Real Time PCR System在第二个循环周期的60°C退火阶段采集FAM和HEX通道的荧光数据。