[发明专利]寡褐藻胶裂解酶OalC6的制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种外切型寡褐藻胶裂解酶及其编码基因与应用。本发明从海洋细菌Cellulophagasp.SY116中克隆得到新的寡褐藻胶裂解酶基因OalC6，大小2,328 bp，编码775个氨基酸，属于多糖裂解酶PL‑6家族。将该基因在大肠杆菌中进行表达和纯化，得到重组OalC6，分子量大小约为85.9kDa。该酶对褐藻酸钠和褐藻寡糖具有活性，对古洛糖醛酸片段（polyG）具有偏好性。本发明的寡褐藻胶裂解酶在生产生物乙醇开发新能源方面具有潜在的应用价值。

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及一种寡褐藻胶裂解酶OalC6的制备方法及应用。具体地，本发明涉及一种利用重组大肠杆菌制备寡褐藻胶裂解酶OalC6的方法及其应用。

背景技术

我国褐藻胶产量位居全球第一。褐藻胶是多种海藻的细胞壁成分，其基本组成单元为单糖，是由互为差向异构体的甘露糖醛酸（M）和古洛糖醛酸（G）通过1,4糖苷键连接而成的线性多糖。根据其结构特点，褐藻胶多糖可分为三种片段，由多聚甘露糖醛酸构成的PolyM片段、多聚古洛糖醛酸构成的PolyG片段和甘露糖醛酸和古洛糖醛酸交替排列而成的PolyMG片段。

褐藻胶是一种重要的海洋多糖类物质，为多种微生物提供能源物质。绝大多数的海洋细菌通过以下途径进行褐藻胶的利用：首先，细菌分泌至胞外的内切的褐藻胶裂解酶将大分子褐藻胶降解为小分子褐藻胶寡糖；褐藻胶寡糖通过细菌的细胞膜进入细菌体内，在外切的寡褐藻胶裂解酶作用下降解为单糖；单糖经非酶催化作用形成α-酮酸，然后进入ED（Entner-Doudoroff）途径或类似ED途径进一步利用，生成乙醇等。

褐藻胶裂解酶根据其一级序列及三维结构的不同，在碳水化合物多糖裂解酶家族中被划分为7个不同的家族：PL-5、6、7、14、15、17 和18（Tan G et al. Nucleic AcidsRes, 2005, 33: e122）。目前发现的褐藻胶裂解酶大多数为PL-5和PL-7家族。本发明的寡褐藻胶裂解酶OalC6属于PL-6家族，为本家族中第三个寡褐藻胶裂解酶，且其生物活性最高。目前报道的寡褐藻胶裂解酶的降解方式均为外切。

褐藻胶单糖指饱和的和不饱和的古洛糖醛酸和甘露糖醛酸，可用于发酵生产生化试剂或生物燃料。随着人口、经济发展的双重压力，地球生态环境遭到极大的破坏，地球能源日渐枯竭。生物能源作为一种重要的替代能源，世界各国空前关注。目前生物能源原料多为陆生农作物，我国人口众多，粮食需求压力长期存在，不可能大量利用粮食生产生物燃料。而利用褐藻胶作为新能源生产生物乙醇已经成为一种全新的尝试。利用褐藻胶为原料生产生物乙醇过程中将褐藻胶转化为单糖是其中必须的一步。Wargacki等将褐藻胶降解相关基因转化入大肠杆菌和酵母菌中，利用大肠杆菌和酿酒酵母以褐藻胶为能源产生生物乙醇（Wargacki AJ et al. Science, 2012, 335: 308-313）。我国在此领域还属起步阶段，本发明的寡褐藻胶裂解酶生物活性高，具有良好的应用前景。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种新型寡褐藻胶裂解酶OalC6。

本发明的第二个目的是提供包含上述寡褐藻胶裂解酶的基因工程菌及其构建方法。

本发明的另一个目的是提供上述寡褐藻胶裂解酶的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：

一种寡褐藻胶裂解酶基因oalC6，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

上述寡褐藻胶裂解酶基因oalC6编码的寡褐藻胶裂解酶OalC6，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。