[发明专利]一种昆虫卵巢内共生菌的荧光原位杂交方法

说明书

本发明涉及一种昆虫卵巢内共生菌的荧光原位杂交方法，包括以下步骤：先在显微镜下解剖昆虫卵巢，转移至载玻片并加入昆虫组织固定液进行固定，加入脱色液进行脱色。再对标本进行预杂交和杂交染色，杂交完成后，加入洗脱液进行洗脱。最后用甘油对样品进行封片，在共聚焦显微镜下进行观察拍照。本发明方法既能够保持良好的细胞染色效果，又可以简化操作、缩短时间、节省试剂、降低成本。本发明可以同时对卵巢内几种共生菌进行多重染色，具有良好的染色效果，且方法简便、快速、经济。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及昆虫卵巢内共生菌的原位杂交方法。

背景技术

昆虫内共生菌是生活在昆虫体内与宿主协同进化的一类共生微生物，参与宿主的营养代谢，为宿主提供营养物质，具有增强宿主对天敌的防御能力、调节寄主的耐热性及增强宿主抗药性等功能。内共生菌的感染对宿主的生殖、存活及其对环境的适应能力具有重要的影响，被认为是昆虫生长发育过程中的重要调控因子。内共生菌在发挥的作用与其在昆虫组织中的分布位置息息相关，一些共生菌主要在卵巢和精巢中分布，参与调控宿主的生殖活动。

荧光原位杂交技术是利用碱基互补的原则将荧光探针与组织中序列结合，对靶标序列进行定位、定性或定量分析的一项技术，优点在于操作简单、反应灵敏、无非特异性染色，利用该项技术可以实现共生菌在昆虫体内快速定位。

传统的昆虫组织荧光原位杂交染色方法一般需要对昆虫组织进行冷冻和切片，在操作上比较繁琐、耗时耗力，一次实验需要2-3天才能完成。因此，需要对此方法进行改进和优化，既能够保持良好的细胞染色效果，又可以简化操作、缩短时间、节省试剂、降低成本。可以同时对卵巢内几种共生菌进行多重染色，具有良好的染色效果，且方法简便、快速、经济。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种昆虫卵巢内共生菌的荧光原位杂交方法，技术方案如下：

一种昆虫卵巢内共生菌的荧光原位杂交方法，包括：先在显微镜下解剖昆虫卵巢，转移至载玻片并加入昆虫组织固定液进行固定，加入脱色液进行脱色；再对标本进行预杂交和杂交染色，杂交完成后，加入洗脱液进行洗脱；最后用甘油对样品进行封片，在共聚焦显微镜下进行观察拍照。

具体地，上述昆虫卵巢内共生菌的荧光原位杂交方法，包括如下步骤：

(1)在培养皿中加入PBS缓冲液，将待解剖的雌性昆虫成虫放入PBS缓冲液中；

(2)在体视解剖镜下，用昆虫针固定昆虫胸部腹板，用解剖针剖开昆虫腹部，将卵巢全部拉出，去除虫体残壳等杂物；

(3)在载玻片中央滴加3-5滴PBS缓冲液，用细毛笔将培养皿中的卵巢挑入载玻片上的PBS缓冲液中；

(4)用滤纸吸去载玻片上卵巢周围的PBS缓冲液，并立即加入200ul昆虫组织固定液固定10min-20min，用移液器或滤纸吸去卵巢周围的PBS固定液，再次加入200ul固定液固定20min-1h；期间不断加入固定液以避免载玻片干燥；

(5)样品固定完成后，用移液器或滤纸吸去玻片上卵巢周围的PBS固定液，加入用200ul蒸馏水清洗三次，每次5min；吸去卵巢周围的蒸馏水，并立即加入200ul脱色液，脱色时间为10-30min；重复上述步骤，对样本进行三次脱色；

(6)将载玻片置于显微镜下观察，在载玻片背面用记号笔圈下卵巢样品在载玻片上的位置；将载玻片放入37℃烘箱中干燥10-20min以固定卵巢；

(7)预杂交：在载玻片上标记的昆虫卵巢的位置加入200-400ul已37℃预热的未加探针的杂交液，预杂交10-20min；

(8)杂交：用滤纸吸去预杂交液，在载玻片上标记的昆虫卵巢的位置加入200-400ul已37℃预热的含探针的杂交液，载玻片放在杂交湿盒中于37℃杂交20min-1h；