[发明专利]一种昆虫卵巢内共生菌的荧光原位杂交方法

权利要求书

1.一种昆虫卵巢内共生菌的荧光原位杂交方法，其特征在于，包括：先在显微镜下解剖昆虫卵巢，转移至载玻片并加入昆虫组织固定液进行固定，加入脱色液进行脱色；再对标本进行预杂交和杂交染色，杂交完成后，加入洗脱液进行洗脱；最后用对样品进行封片，在共聚焦显微镜下进行观察拍照。

2.根据权利要求1所述的荧光原位杂交方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)在培养皿中加入PBS缓冲液，将待解剖的雌性昆虫成虫放入PBS缓冲液中；

(2)在体视解剖镜下，用昆虫针固定昆虫胸部腹板，用解剖针剖开昆虫腹部，将卵巢全部拉出，去除虫体残壳等杂物；

(3)在载玻片中央滴加3-5滴PBS缓冲液，用细毛笔将培养皿中的卵巢挑入载玻片上的PBS缓冲液中；

(4)用滤纸吸去载玻片上卵巢周围的PBS缓冲液，并立即加入200ul昆虫组织固定液固定10min-20min，用移液器或滤纸吸去卵巢周围的PBS固定液，再次加入200ul固定液固定20min-1h；期间不断加入固定液以避免载玻片干燥；

(5)样品固定完成后，用移液器或滤纸吸去玻片上卵巢周围的PBS固定液，加入用200ul蒸馏水清洗三次，每次5min；吸去卵巢周围的蒸馏水，并立即加入200ul脱色液，脱色时间为10-30min；重复上述步骤，对样本进行三次脱色；

(6)将载玻片置于显微镜下观察，在载玻片背面用记号笔圈下卵巢样品在载玻片上的位置；将载玻片放入37℃烘箱中干燥10-20min以固定卵巢；

(7)预杂交：在载玻片上标记的昆虫卵巢的位置加入200-400ul已37℃预热的未加探针的杂交液，预杂交10-20min；

(8)杂交：用滤纸吸去预杂交液，在载玻片上标记的昆虫卵巢的位置加入200-400ul已37℃预热的含探针的杂交液，载玻片放在杂交湿盒中于37℃杂交20min-1h；

(9)洗脱：杂交完成后，用移液器或滤纸吸去杂交液，用48℃预热的洗脱液200-400ul避光洗脱5-10min，吸去洗脱液，重复洗脱一次，时间20min；蒸馏水冲洗样本去除洗脱液；

(10)甘油封片：在样本上滴加含50％PBS的甘油，用镊子盖上盖玻片，滤纸吸去多余的甘油，最后用指甲油沿盖玻片周围封片；

(11)采用荧光显微镜观察，按照所标记的样本的位置可观察到卵巢内共生菌的荧光信号，对样本进行拍照和分析。

3.根据权利要求1或2所述的荧光原位杂交方法，其特征在于，所用脱色液为含6％双氧水的酒精混合液。

4.根据权利要求1或2所述的荧光原位杂交方法，其特征在于，所述昆虫组织固定液为Carnoy’s固定液或4％多聚甲醛中性缓冲液。

5.根据权利要求1-4任一项所述的荧光原位杂交方法，其特征在于，所述昆虫包括烟粉虱、蚜虫、丽蚜小蜂、蓟马、温室白粉虱、蚜茧蜂、赤眼蜂、叶螨。

6.根据权利要求1-5任一项所述的荧光原位杂交方法，其特征在于，针对烟粉虱卵巢内共生菌Wolbachia荧光原位杂交，用荧光探针

W2：Cy5-CTTCTGTGAGTACCGTCATTATC。

7.根据权利要求1-5任一项所述的荧光原位杂交方法，其特征在于，针对温室白粉虱卵巢内共生菌Portiera的荧光原位杂交所用荧光探针为

BTP1：Cy3-TGTCAGTGTCAGCCCAGAAG。