[发明专利]一种代谢物-蛋白质相互作用体系筛选和表征方法

说明书

本发明公开了一种基于代谢组学及结构质谱技术的代谢物‑蛋白质相互作用体系筛选和表征方法，通过亲和固载方法将异源表达的带有标签的靶标蛋白进行固定，再将其与代谢物提取物共同孵育，最后将靶标蛋白‑代谢物复合物分离及变性洗脱后进行非靶向代谢组学分析，对比其与对照组(没有固定蛋白的亲和载体)差异，从而筛选出与靶标蛋白具有潜在相互作用的代谢物。继而利用结构质谱对潜在相互作用体系进行直接验证。该结合方法即能够高通量筛选与靶标蛋白具有潜在相互作用代谢物，利用结构质谱的直接表征又能筛除间接表征过程中可能引入的假阳性互作结果。该方法是一种可靠的蛋白质‑代谢物相互作用高通量研究手段。

技术领域

本发明涉及分析化学和生物化学领域，是一种结合代谢组学的间接筛选及结构质谱技术直接表征这两种技术路线的代谢物-蛋白质相互作用体系的高通量筛选和表征方法。

背景技术

内源性代谢物小分子是胞内分子化合物的主要成分，并且各种代谢物分子在胞内浓度分布上具有较大差异。其所涉及的与多种多样的蛋白质的相互作用(无论是通过以产物/底物的形式参与酶促反应过程，或是以变构辅因子/配体的形式变构调控蛋白质)，已被证明可以控制生化反应中的物质能量代谢并且能通过信号传导来调节整个生理过程。因此，解析阐述生理条件下的代谢物-蛋白质相互作用能够揭示隐藏在疾病/健康状态下的分子理论基础，对于人类健康与医药发展至关重要。此外，疾病相关蛋白质的代谢调节剂还可能为潜在的治疗干预措施提供新的策略。

尽管研究者们已经发现了数量可观的代谢物-蛋白质相互作用，但基于代谢体系的复杂性以及缺乏有效的表征手段，只有其中的一小部分所涉及的相互作用网络被研究透彻。常见的用以表征代谢物-蛋白质相互作用的研究手段包括荧光光谱法、表面等离子体共振、等温滴定量热法、核磁共振法等，但大多数这样的研究手段均需要在分析之前对蛋白质/配体进行标记、蛋白质固载或者其他额外的操作，故而可能产生假阳性的代谢物-蛋白质互作研究结果。随着质谱技术的发展，高分辨质谱逐渐成为了代谢物-蛋白质相互作用的新型研究平台。Saghatelian等在体外异源表达了靶标蛋白，利用代谢组学的手段筛选了与该蛋白可能具有相互作用的代谢物，但存在材料吸附过程中产生非特异性吸附从而引入假阳性结果的可能；Klassen等利用结构质谱技术能够直接表征小分子-蛋白质之间的相互作用，并且能够获得相关的热力学及动力学参数，但这种方法不能够大批量的筛选与靶标蛋白具有相互作用的代谢物，仅仅适用较为简单的研究体系。针对这样的研究现状，开发一种基于高分辨质谱的代谢物-蛋白质筛选和表征新方法很有必要。

发明内容

本发明针对现有方法的不足，建立了结合代谢组学的间接筛选及结构质谱技术直接表征的代谢物-蛋白质相互作用体系的高通量筛选和表征方法。该方法可在体外大批量筛选与靶标蛋白有潜在相互作用的代谢物，并利用结构质谱技术对潜在的代谢物-蛋白质复合物进行直接表征，从而可靠性的表征代谢物-蛋白质相互作用，为了解机体的生理过程及疾病的发生发展机制等提供依据。该方法具有检测可靠性高、灵敏度好、通量大等优点。

本发明采用的技术路线如下：

(1)在大肠杆菌中异源过量表达带有组氨酸(His6-)标签的靶标蛋白。利用超声破碎仪对菌株进行破碎，破碎时间为30min。然后将蛋白裂解液与镍离子树脂共同孵育，利用His6-标签蛋白与镍离子树脂之间的亲和作用富集靶标蛋白。将镍离子树脂用含有20mM咪唑的缓冲液洗涤3-4次，再利用含有500mM的缓冲液对镍离子树脂进行洗脱从而得到靶标蛋白。