[发明专利]一种乳腺癌分子分型实时荧光多重PCR引物及试剂盒与应用

权利要求书

1.一种乳腺癌分子分型实时荧光多重PCR引物和探针，其特征在于包含雌激素受体α66基因引物、孕激素受体基因引物、人类表皮生长因子受体2基因引物，其核苷酸序列分别如下所示：

ER-α66-F：CATGGTGGAGATCTTCGA；

ER-α66-R：GTGCTGGACAGAAATGTG；

PR-F：ACCACGGTGATGGATTTC；

PR-R：CGTCGTAACTTTCGTCTTC；

Her2-F：CTTCCACAAGAACAACCA；

Her2-R：CTGACAATCCTCAGAACTC；

还包含雌激素受体α66基因探针、孕激素受体基因探针和类表皮生长因子受体2基因探针，其核苷酸序列分别如下所示：

ER-α66-probe：CTGCTGGCTACATCATCTCGGT；

PR-probe：CGTGCCTATCCTGCCTCTCA；

Her2-probe：ACACTGATAGACACCAACCGCT。

2.一种乳腺癌分子分型实时荧光多重PCR快速检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包含权利要求1所述的引物和探针。

3.根据权利要求2所述的乳腺癌分子分型实时荧光多重PCR快速检测试剂盒，其特征在于还包含β-actin基因引物和探针，其核苷酸序列分别如下所示：

β-actin-F：TGCAGAAGGAGATCACTG；

β-actin-R：CTTGCTGATCCACATCTG；

β-actin-probe：AAGATCAAGATCATTGCTCCTCCTGA。

4.根据权利要求3所述的乳腺癌分子分型实时荧光多重PCR快速检测试剂盒，其特征在于：

所述的雌激素受体α66基因探针、孕激素受体基因探针、类表皮生长因子受体2基因探针和β-actin基因探针的荧光标记分别为：FAM、VIC、Cy5和YAK。

5.根据权利要求2所述的乳腺癌分子分型实时荧光多重PCR快速检测试剂盒，其特征在于：

所述的试剂盒还包括2×RT-PCR Buffer和25×RT-PCR Enzyme。

6.根据权利要求2所述的乳腺癌分子分型实时荧光多重PCR快速检测试剂盒，其特征在于：

所述的试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。

7.权利要求1所述的乳腺癌分子分型实时荧光多重PCR引物和探针与权利要求2～6任一项所述的试剂盒在制备检测乳腺癌分子分型产品中的应用。

8.一种乳腺癌分子分型方法，其特征在于包含如下步骤：

(1)提取待测样品RNA；

(2)配制RT-PCR反应体系：步骤(1)制得的RNA 10μl，2×RT-PCR Buffer 12.5μl，25×RT-PCR Enzyme Mix 1μl，权利要求2～7任一项所述的试剂盒中引物/探针组合1.5μl，其中，模板终浓度为5μM，各引物/探针终浓度为0.5μM；

(3)进行RT-PCR反应；

(4)根据扩增曲线Ct值，判断雌激素受体-α66基因、孕激素受体基因、人类表皮生长因子受体2基因表达情况；如某种受体基因相应的荧光信号产生指数Ct值小于33，则为阳性，否则为阴性；

所述的方法不包含疾病的治疗与诊断目的。

9.根据权利要求8所述的乳腺癌分子分型方法，其特征在于：

所述的RT-PCR反应的反应程序为：50℃保持15min，95℃保持10min；95℃维持8s，60℃维持34s，40个循环。