[发明专利]一种从PCR混合产物中分离回收大小差异微小的核酸分子的方法

说明书

本发明涉及一种从PCR混合产物中分离回收大小差异微小的核酸分子的方法，其包括以下步骤：经PCR获得含有目的片段的混合DNA产物；通过聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳将混合物中的不同DNA分子分开；核酸染料DNAgreen染色PAGE胶片；在紫外灯下切割下含有目的片段凝胶部分，用研磨棒将凝胶研磨至稀泥状；在凝胶中加入TE溶液，加热处理；混合物离心处理，保留上清液；使用实验室现有的普通的PCR产物纯化试剂盒从上清液中回收获得含有目的片段的溶液；将以上溶液直接作为PCR模板，扩增产物直接测序，获得目的DNA分子的序列信息。本发明具有以下优点：快捷方便；成本低；安全；质量高；效果好；资源整合利用。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种从PCR混合产物中分离回收大小差异微小的核酸分子的方法。

背景技术

高等生物染色体组本身较为庞大，加之进化过程中出现的染色体加倍和基因重复等现象，使得其基因组更为复杂。如人是二倍体生物，有46条染色体，基因组总量达到3Gb；棉花有二倍体和四倍体之分，四倍体棉种有52条染色体，最新的陆地棉基因组测序数据显示其基因组总量达2.5Gb；小麦分为一粒小麦、二粒小麦和六倍体普通小麦，普通小麦有42条染色体，基因组总量高达17Gb，且80%以上是重复序列。在基因组序列克隆过程中，等位基因、同源基因和重复序列等的存在，使得某些位置很难提取到单一的目的片段，PCR获得的往往是多种DNA分子的混合产物。

近年来，深度测序逐渐流行，但其价格的昂贵使得受众面偏低，且该方法属于大数据信息量获取。对于小样本量单基因测序，Sanger测序法依然是最好的选择，该方法经济且高效，也是深度测序检测后进行进一步基因鉴定的主要手段。但是Sanger测序存在其局限性，当PCR产物中含有两种及以上DNA分子时，测序过程会出现双峰或杂峰影响测序进程，导致测序不准确或失败。因此，在利用Sanger直接测序时，需要使用严格的特异性引物以获得单一的DNA分子。若得到的PCR产物中仍然含有多种片段，则需要通过凝胶电泳等方法进行分离纯化最终得到单一的DNA分子产物。

本实验室主要利用SSR（简单重复序列）标记从事棉花相关性状基因的定位研究。在实验过程中，我们发现一些非特异性条带有时具有重要的科研价值，因此偶尔需要利用凝胶分离回收此类片段大小具有微小差异的核酸分子进行测序。目前国内市场上，琼脂糖凝胶回收试剂盒的开发已经很成熟，大多采用核酸在高盐浓度下结合到二氧化硅基质而在低盐环境下脱离的原理。该种类试剂盒十分经济有效，在一般实验室使用的十分普遍，但琼脂糖凝胶分辨率较低，只能分离开大小差异较大的核酸分子，对于微小差异的片段则需要使用更高分辨率的PAGE胶进行分离。目前从PAGE胶回收核酸采取的主要方法是：1）将PAGE胶破碎后在60度水浴溶解3小时以上；2）使用酚氯仿抽提去除杂质；3）乙醇沉淀核酸；4）加水溶解获得核酸产物，此方法过程中使用的酚氯仿属于高腐蚀性有毒物质，不够安全。也可以将PAGE胶装入透析带进行电洗脱，但此法不仅操作麻烦且十分耗时。已有的PAGE胶回收试剂盒同样也需要将PAGE胶破碎后在60度水浴溶解3小时，且价格较贵（300元以上/50次）。此外，也有发明专利将含有目的核酸分子的聚丙烯酰胺胶放在琼脂糖胶孔中再次电泳，再从琼脂糖胶中回收核酸片段，该方法增加了操作上的步骤和回收的风险。

参考已有的方法，结合本实验室的实际情况和实验的需求，我们做了以下考虑：1、现有的PAGE胶回收试剂盒回收时间过长（通常需要4小时以上），其价格较高（300元以上/50次），且只能回收小片段（500bp以下），而一般实验室使用PAGE胶回收试剂盒的频率较低，对于较大的片段试剂盒也不是很有效，可能造成不必要的浪费；2、应尽量避免有毒有害物质的使用，减少实验步骤，使实验更加安全简便；3、由于所得到的回收产物需要进行下一步PCR实验，因此回收产物需要去除杂质，不能含有不利于下一步实验的有害物质；4、本实验室常年使用PCR产物纯化试剂盒（100元/50次），是否可以与之结合使用从而有效利用实验室现有资源获得高质量的产物。基于这几点考虑，我们创建了本发明，可以使用普通实验室已有资源快速有效分离和提取大小差异微小的核酸片段。

发明内容