[发明专利]一种检测狂犬病毒的试剂及其应用

说明书

本发明涉及兽医病原微生物检测技术领域，公开了一种检测狂犬病毒的试剂及其应用。本发明所述试剂由SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物、SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游引物、SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的探针组成。本发明提供了一组适用于RPA的引物和探针试剂，所述试剂能够准确检测出狂犬病毒，并具备较高特异性、灵敏度和准确性，弥补了现有RPA检测技术缺少效果优异检测试剂的缺陷。

技术领域

本发明涉及兽医病原微生物检测技术领域，具体涉及一种检测狂犬病毒的试剂及其应用。

背景技术

狂犬病毒(Rabies virus,RV)属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病毒属(Lyssavirus)。外形呈弹状，核衣壳呈螺旋对称，表面具有包膜，内含有单链RNA。是引起狂犬病的病原体。狂犬病流行范围甚广，全世界几乎所有地区均有报道。因狂犬病死亡的患者99％分布在非洲和亚洲，其中56％在亚洲44％在非洲。我国是狂犬病的严重流行地区，近几年来发病数呈上升趋势，因此，急需快速确诊该病的检测技术，为狂犬病的现场实验诊断和流行病学调查提供新方法。

目前病毒核酸检测的主要方法为PCR方法，常规的PCR检测需要特殊的热循环仪器以及繁琐的试验程序，难以满足现场或田间条件下的检测需要。近年来，一些核酸等温扩增技术逐渐发展起来，这些技术不需要昂贵的PCR仪，并且可以在短时间内快速大量扩增出目的片段，具有简单、快速、灵敏度高等优点。其中的RPA技术更是被称为可以替代PCR的核酸检测技术。

RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在37℃左右。RPA技术是模拟了生物体内DNA复制、基于重组酶聚合酶介导的扩增原理发展而来。它可以在非常短的时间内使目的基因以指数级增长，若配合荧光标记的探针和荧光信号检测仪便可实现对模板扩增的实时监测。RPA技术大大减少了检测时间，简化了反应程序，结合快速核酸提取技术和便携式的实时荧光检测设备后非常适于现场或田间检测，具有广阔的应用前景。利用RPA技术检测狂犬病毒具有重大的临床应用价值。

RPA分析的关键在于扩增引物和探针的设计，其引物和探针的设计不像传统PCR那样成熟，而PCR引物也多半不适用于RPA。RPA引物设计原则一般有如下几点：

(1)5’端3到5个核苷酸避免聚鸟嘌呤，最好是胞嘧啶，能促进重组；(2)3’端3个核苷酸是G或C有助于聚合酶的稳定性；(3)不要出现聚嘌呤和嘧啶；(4)GC含量在30-70％之间避免形成二级结构，发卡结构等；(5)靶标区域避开重复元件。

由于目前没有针对RPA的引物设计软件，上述引物设计原则也仅是一种概括性的设计原则，如果需要获得较好的扩增效果，例如特异性、灵敏度方面，则需要技术人员人为摸索条件进行设计优化。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测狂犬病毒的试剂，使得所述试剂能够适用于RPA，并具有较高的特异性、灵敏度和准确性；

本发明的另外一个目的在于提供上述试剂在制备检测狂犬病毒试剂盒中的应用。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种检测狂犬病毒的试剂，由SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物、SEQ IDNO:2所示核苷酸序列的下游引物、SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的探针组成。

在本发明具体实施方式中，所述试剂中引物和探针序列如下：

上游引物CTCTGGTGGAGATAAAACGTACTGATGTAG(SEQ ID NO:1)；

下游引物CTCAACCTATACAGACTCAAGAGAAGACCG(SEQ ID NO:2)；