[发明专利]金纳米团簇为荧光探针的精氨酸酶及其抑制剂的测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及以6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米团簇为荧光探针的精氨酸酶及其抑制剂的测定方法，属于分析化学及纳米技术领域。

背景技术

精氨酸酶主要存在于哺乳动物的肝、肾、肠和心肌细胞中。它能催化水解精氨酸生成鸟氨酸与尿素，是鸟氨酸循环重要酶系之一。精氨酸酶活性测定是肝癌、肝硬变及各类肝炎的检测指标之一。在患有肝病患者的血清中，该酶存在较高的活性水平。此外在降低血氨及平衡体内的pH值、辅助心肌梗塞的诊断等方面也具有一定的意义。尽管该酶的测定有着重要的临床价值，但以往报道的测定方法多数操作繁琐，灵敏度低，不适于临床大量标本的实验室应用。其传统测定方法为借助茚三酮反应测定酶促反应所生成的鸟氨酸，或借助Fearon反应检测所生成的尿素。二者灵敏度均较低，并且都是通过比色的方法间接测定反应产物，当复杂生物样品本身存在尿素等物质时，并不能准确的反应精氨酸的真实水平。

金纳米团簇（gold nanoclusters，AuNCs）是一种新型的荧光纳米材料，其具有尺寸小、无毒、水溶性好、光稳定性好、Stokes位移大、比表面积大、制备条件温和、表面易于修饰以及荧光性质随尺寸可调等突出优点，是近年来的研究热点。其已被广泛应用于催化、传感检测、纳米标记、医学成像和光电子学等领域。

本发明以6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米团簇作为荧光探针，提供了一种简便、灵敏的精氨酸酶及其抑制剂的检测新方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种以6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米团簇为荧光探针的精氨酸酶及其抑制剂的测定方法。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种金纳米团簇为荧光探针的精氨酸酶及其抑制剂的测定方法，其特征是通过添加L-精氨酸显著增强6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米团簇的荧光强度，而精氨酸酶能特异性水解L-精氨酸，从而减弱由L-精氨酸引起的荧光增强现象，利用荧光光谱的特征变化，直接用于精氨酸酶及其抑制剂的测定。

所使用的6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米团簇采用6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶直接还原氯金酸的方法制备：15 mL浓度为80 mmol/L的含0.2 mol/L氢氧化钠的6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶与15 mL浓度为10 mg/mL的氯金酸溶液混合均匀，室温下磁力搅拌1小时，反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行纯化处理，纯化后获得的6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米团簇溶液的浓度为3.3 mg/mL，所述的6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米团簇溶液为黄色，紫外灯照射下具有绿色荧光；置于冰箱4℃避光保存。

利用6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米团簇在526 nm处的荧光强度变化值ΔF以判断精氨酸酶及其抑制剂的含量，所使用的激发波长为472 nm。

本发明所述的金纳米团簇为荧光探针的精氨酸酶的测定方法，其特征是精氨酸酶的测定过程如下：150 μL浓度为2.0 mg/mL 的溶于50 mmol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液的6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米团簇溶液加入到150 μL溶于50 mmol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液的L-精氨酸溶液中，然后再加入100 μL溶于50 mmol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液的样品溶液，充分混匀后置于15~60℃水浴锅中孵育2小时，反应结束后，以472 nm为激发波长，测定溶液在526 nm处的荧光强度值，并计算荧光强度变化值∆F，通过荧光强度变化值∆F标准曲线进行精氨酸酶的测定。

所使用的L-精氨酸浓度优选为2.5 mmol/L，甘氨酸-氢氧化钠缓冲液的pH值优选为9.8，反应温度优选为37℃。

所精氨酸酶测定的线性范围为0.0625~1.15 U/mL，最低检测限为0.056 U/mL。