[发明专利]金纳米团簇为荧光探针的精氨酸酶及其抑制剂的测定方法

权利要求书

1.一种金纳米团簇为荧光探针的精氨酸酶及其抑制剂的测定方法，其特征是通过添加L-精氨酸显著增强6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米团簇的荧光强度，而精氨酸酶能特异性水解L-精氨酸，从而减弱由L-精氨酸引起的荧光增强现象，利用荧光光谱的特征变化，直接用于精氨酸酶及其抑制剂的测定。

2.根据权利要求1所述的金纳米团簇为荧光探针的精氨酸酶及其抑制剂的测定方法，其特征是所使用的6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米团簇采用6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶直接还原氯金酸的方法制备：15 mL浓度为80 mmol/L的含0.2 mol/L氢氧化钠的6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶与15 mL浓度为10 mg/mL的氯金酸溶液混合均匀，室温下磁力搅拌1小时，反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行纯化处理，纯化后获得的6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米团簇溶液的浓度为3.3 mg/mL，所述的6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米团簇溶液为黄色，紫外灯照射下具有绿色荧光；置于冰箱4℃避光保存。

3.根据权利要求1或2所述的金纳米团簇为荧光探针的精氨酸酶及其抑制剂的测定方法，其特征是利用6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米团簇在526 nm处的荧光强度变化值ΔF以判断精氨酸酶及其抑制剂的含量，所使用的激发波长为472 nm。

4.一种金纳米团簇为荧光探针的精氨酸酶的测定方法，其特征是精氨酸酶的测定过程如下：150 μL浓度为2.0 mg/mL 的溶于50 mmol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液的6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米团簇溶液加入到150 μL溶于50 mmol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液的L-精氨酸溶液中，然后再加入100 μL溶于50 mmol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液的样品溶液，充分混匀后置于15~60℃水浴锅中孵育2小时，反应结束后，以472 nm为激发波长，测定溶液在526 nm处的荧光强度值，并计算荧光强度变化值∆F，通过荧光强度变化值∆F标准曲线进行精氨酸酶的测定。

5.根据权利要求4所述的一种金纳米团簇为荧光探针的精氨酸酶的测定方法，其特征是所使用的L-精氨酸浓度优选为2.5 mmol/L，甘氨酸-氢氧化钠缓冲液的pH值优选为9.8，反应温度优选为37℃。

6.根据权利要求4所述的一种金纳米团簇为荧光探针的精氨酸酶的测定方法，其特征是所精氨酸酶测定的线性范围为0.0625~1.15 U/mL，最低检测限为0.056 U/mL。

7.一种金纳米团簇为荧光探针测定SD大鼠肝脏精氨酸酶的方法，包括如下步骤：取SD大鼠的肝脏组织，剪碎后匀浆处理，分次加入冰冷的蔗糖溶液，离心，取上清液加入pH为9.1的饱和硫酸铵溶液，静置，离心，去除上清后将沉淀用50 mmol/L，pH=9.8的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液溶解，最后用10 KDa分子量的超滤管离心，超滤纯化，得精氨酸酶测定样品溶液；150 μL浓度为2.0 mg/mL 的溶于50 mmol/L 、pH=9.8的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液的6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米团簇溶液加入到150 μL浓度为2.5 mmol/L的溶于50 mmol/L、 pH=9.8的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液的L-精氨酸溶液中，然后再加入100 μL样品溶液，充分混匀后置于37℃水浴锅中孵育2小时，反应结束后，以472 nm为激发波长，测定反应液的荧光强度值F₅₂₆，并计算荧光强度变化值∆F，通过荧光强度变化值∆F标准曲线进行定量，获得SD大鼠肝脏样品中精氨酸酶的含量。

8.根据权利要求7所述的一种金纳米团簇为荧光探针测定SD大鼠肝脏精氨酸酶的方法，其特征是所使用的6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米团簇采用以下方法制备： 15 mL浓度为80 mmol/L的含0.2 mol/L氢氧化钠的6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶与15 mL浓度为10 mg/mL的氯金酸溶液混合均匀，室温下磁力搅拌1小时，反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行纯化处理，纯化后获得的6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米团簇溶液的浓度为3.3 mg/mL，所述的6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米团簇溶液为黄色，紫外灯照射下具有绿色荧光；置于冰箱4℃避光保存。

9.一种金纳米团簇为荧光探针的精氨酸酶抑制剂的测定方法，其特征是将均溶于50 mmol/L 、pH=9.8的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中的不同浓度的L-戊氨酸溶液与浓度为8 U/mL的精氨酸酶溶液按体积比1：1混合均匀后得到抑制剂测定的样品溶液；将150 μL浓度为2.0 mg/mL 的溶于50 mmol/L 、pH=9.8的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液的6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米团簇溶液加入到150 μL浓度为2.5 mmol/L的溶于50 mmol/L 、pH=9.8的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液的L-精氨酸溶液中，然后再加入100 μL样品溶液，充分混匀后置于37℃水浴锅中孵育2小时，反应结束后，以472 nm为激发波长，测定溶液在526 nm处的荧光强度值F₅₂₆，计算抑制率，通过软件拟合得到L-戊氨酸的IC₅₀值为5.6 mmoL/L。