[发明专利]一种利用便携式拉曼光谱仪快速检测金黄色葡萄球菌的方法

说明书

本发明涉及一种利用便携式拉曼光谱仪快速检测金黄色葡萄球菌的方法。主要通过无机盐试剂对金纳米粒子溶胶进行特异性优化，使金纳米粒子溶胶与样品中金黄色葡萄球菌相互作用，从而提高拉曼光谱的信号强度和和可重复性，以比较简便的方法实现了在短时间内测定金黄色葡萄球菌的目的。同时选用便携式拉曼光谱仪，可实现现场的快速致病菌测定，避免的实验室大型仪器的复杂操作及检测时间。

技术领域

本发明涉及一种基于表面增强拉曼光谱技术，利用便携式拉曼光谱仪快速检测金黄色葡萄球菌的方法，属于食源性致病菌分析检测领域。

背景技术

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种球形革兰氏阳性菌，为常见的食源性致病菌，可引起许多严重感染，在环境以及人类的皮肤上广泛分布。通常情况下金黄色葡萄球菌不致病，但受伤的皮肤感染金葡菌后会引起严重的感染，症状为胃痛、腹泻、呕吐和发热，引起如腹膜炎、膀胱炎、胆囊炎等疾病，甚至疾病暴发流行，病情严重者，可危急生命。据世界卫生组织估计，每年全球有数十亿人感染上食源性疾病，如今，食源性疾病使全球食品安全面临巨大威胁。我国GB 19295-2011《食品安全国家标准规定速冻米面制品》中金黄色葡萄球菌的最大限量为1000CFU/g。

多年来科研工作者一直在研究快速、准确的方法来检测食品中的致病菌，目前，微生物的检测方法主要有：传统的增菌、菌落分离和血清学鉴别、生化鉴定方法。这些方法可准确对致病菌进行鉴定，但缺点是必须进行预增菌，从取样到定性鉴别、定量微生物，至少需要一天以上的时间。聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）法是以核酸分子为探针高灵敏的检测技术，此技术虽然在数小时内可以得到检测结果，但是需要熟练的专业操作能力以及较长的前期准备，而且临床检测结果假阳性率偏高。酶联免疫吸附法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)，是一种将细菌表面抗原与抗体特异性反应和酶的高效催化作用原理有机结合的免疫学分析方法，该方法已经比较成熟，具有特异性强，灵敏度高，结果直观易观察的优点，但是抗体制备过程复杂、不稳定且价格昂贵。

表面增强拉曼（SERS）技术具有特异性高、选择性强、灵敏度高的优点，可以从分子水平上鉴别物质，因此被广泛用于食品检测，免疫学，环境分析，生物化学，珠宝鉴定等多个方面，随着其发展也逐渐渗透到分子生物学和微生物学领域。和其他微生物检测技术不同的是SERS检测前处理简单、水干扰小，可以省去微生物技术中的预增菌、提取和纯化步骤，节省大量的时间，通过拉曼光谱仪检测出分子的特征拉曼位移，能够尽可能多的从生物样品中获取其化学信息，提供细菌的指纹图谱，从而根据它们的拉曼光谱对细菌种类进行鉴别。但是目前技术中，由于难以控制纳米颗粒与细菌的结合，因此在不同的条件下，测得的拉曼光谱有一定的差异，病原菌信号具有重复性差的问题，而且大型拉曼光谱仪不适合突发性致病菌事件的快速检测响应。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中方法的不足，提供一种便携式拉曼光谱仪快速检测金黄色葡萄球菌的拉曼增强光谱方法，通过向金纳米粒子溶胶中加入调控细菌与纳米颗粒相结合的无机盐试剂，从而提高光谱的信号强度和和可重复性。该方法灵敏度高，特异性强，检测速度快，成本低廉，克服了鉴别细菌时谱图重复性差的问题。

本发明通过如下步骤实现。

（1）选择检测金黄色葡萄球菌：使用BHI培养基中培养震荡冷冻的金黄色葡萄球菌，37^oC条件下200 r/min培养10小时，取10 mL细菌培养液，用去离子水在5000 r/min下洗涤2 min、洗涤两次，然后将细菌贮存在4^oC冰箱中等待检测。

（2）配制含无机阴离子浓度为0.05~2 mol/L的无机阴离子溶液。

（3）将透明载玻片用王水（浓盐酸：浓硝酸v/v=3:1）浸泡清洗，去除表面杂质，用去离子水洗涤数遍，氮气吹干备用。