[发明专利]接种菌剂玉米的根际原核微生物多样性检测方法

说明书

一种接种菌剂玉米的根际原核微生物多样性检测方法，通过从种植有玉米幼苗的根际土壤中提取宏基因组DNA，通过PCR扩增其中的16SrDNA的V4V5高变区片段以构建文库；经过双端测序后进行分类学单元分类，与文库进行对比和注释，最后通过根际土壤原核微生物的群落结构分析，比较不同处理之间的异同，具体为：Alpha多样性分析、分类学组成分析和Beta多样性分析，得到微生物群体分类。本发明为巨大芽孢杆菌菌剂对根际土壤原核微生物群落影响的准确评估提供了一种新方法。

技术领域

本发明涉及的是一种土壤微生物检测领域的技术，具体是一种基于16S rDNA高通量测序检测施加巨大芽孢杆菌菌剂的玉米根际原核微生物多样性的方法。

背景技术

根际微生物指在植物根系周围，受根系生长影响的土体中的微生物。根际微生物同土壤和植物根际相互作用，能够直接影响土壤的生物化学活性、土壤养分的组成和转化以及植物的生长。因此，根际微生物多样性是土壤理化性质的重要生物指标之一。研究植物根际细菌群落结构能够反映土壤肥力高低，从而揭示施加微生物菌剂对植物根际微环境的影响。

发明内容

本发明针对现有技术检测通量低、规模小、精确度低、覆盖度低等不足，，提出一种玉米根际原核微生物多样性检测方法，利用了16SrDNA高通量测序技术凭借低成本、高通量、流程自动化的优势，实现菌剂对根际土壤原核微生物群落影响的准确评估。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及一种接种菌剂玉米的根际原核微生物多样性检测方法，通过从种植有玉米幼苗的根际土壤中提取宏基因组DNA，通过PCR扩增其中的16SrDNA的V4V5高变区片段以构建文库；经过双端测序后进行分类学单元(OTU)分类，与文库进行对比和注释，最后通过根际土壤原核微生物的群落结构分析，比较不同处理之间的异同，具体为：Alpha多样性分析、分类学组成分析和Beta多样性分析，得到微生物群体分类。

所述的宏基因组DNA，采用OMEGA Soil DNA Kit试剂盒提取得到。

所述的土壤，其中含有不同硝态氮浓度且施加有巨大芽孢杆菌NCT-2菌剂；

所述的土壤，优选在种植有玉米幼苗35天后将玉米植株连根从土中取出，用抖根法收集根际土，混合均匀并去除根毛，于-80℃保存。

所述的巨大芽孢杆菌NCT-2菌剂，通过将58.9％的巨大芽孢杆菌NCT-2发酵液与23.5％的秸秆粉和17.6％的葡萄糖混匀得到。

所述的不同硝态氮浓度，采用但不限于：22mg/kg、72mg/kg、122mg/kg；优选以高温灭菌的巨大芽孢杆菌NCT-2制成对比菌剂，即N1号菌剂：含NCT-2菌剂2+22mg/kg硝态氮、N2号菌剂：含NCT-2菌剂且配有72mg/kg硝态氮、N3号菌剂：含NCT-2菌剂且配有122mg/kg硝态氮、S1号菌剂：含NCT-2灭菌菌剂且配有22mg/kg硝态氮、S2号菌剂：含有NCT-2灭菌菌剂且配有72mg/kg硝态氮、S3号菌剂：含NCT-2灭菌菌剂且配有122mg/kg硝态氮。

所述的巨大芽孢杆菌NCT-2保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.4698。；

所述的秸秆粉取自水稻秸秆，经粉碎后长度小于0.5cm且含水率低于20％。

所述的混匀是指：混合后的菌剂随机选取5个点的样品检测葡萄糖含量，各点之间的葡萄糖含量应无显著差异。

所述的PCR扩增，选用特异性引物515F，如Seq ID No.1所示和907R，如Seq IDNo.2所示分别作为前引物和后引物做PCR扩增所述宏基因组DNA中16SrDNA的V4V5高变区片段以构建文库；