[发明专利]质粒载体及其构建方法、应用

权利要求书

1.具有自我剪切功能的2A元件在构建质粒载体中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述具有自我剪切功能的2A元件选自P2A、T2A或E2A。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述质粒载体含有两个多克隆位点的所述具有自我剪切功能的2A元件。

4.根据权利要求1至3任一项所述的应用，其特征在于，所述质粒载体还包括目的基因，所述目的基因为编码9kDa颗粒溶素的基因和/或15kDa颗粒溶素的基因。

5.一种质粒载体，其特征在于，包括含有两个多克隆位点的具有自我剪切功能的2A元件以及目的基因。

6.根据权利要求5所述的质粒载体，其特征在于，所述具有自我剪切功能的2A元件选自P2A、T2A或E2A。

7.根据权利要求5或6所述的质粒载体，其特征在于，所述目的基因为编码9kDa颗粒溶素的基因和/或15kDa颗粒溶素的基因。

8.根据权利要求5至7任一项所述的质粒载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：取pIRES-EGFP载体，经BamHI、BstXI双酶切切除IRES，获得线性化载体片段；合成带有BamHI与BstXI酶切位点的P2A片段进行双酶切，获得P2A片段，与所述线性化载体连接，构建获得p2A-EGFP载体；

步骤2：取步骤1获得的p2A-EGFP载体经SalI、SacII双酶切获得线性化载体片段；PCR扩增出带有SalI、SacII酶切位点的P2A片段并进行双酶切，获得P2A片段，与所述线性化载体片段连接，构建获得p2A-2A-EGFP载体；

步骤3：取步骤2获得的p2A-2A-EGFP载体经SacII、BamHI双酶切获得线性化载体片段；合成或扩增带有SacII、BamHI酶切位点的GNLYS片段进行双酶切，获得GNLYS片段，与所述线性化载体片段连接，构建获得p2A-GNLYS-2A-EGFP载体；

步骤4：取步骤3制得的p2A-GNLYS-2A-EGFP载体，经XhoI、SacI、EcoRI、SalI中任选2个双酶切，获得线性化载体片段；合成或扩增带有XhoI、SacI、EcoRI、SalI中任选2个酶切位点的GNLYL片段进行双酶切，获得GNLYL片段，与所述线性化载体片段连接，构建p-GNLYL-2A-GNLYS-2A-EGFP载体；或

包括如下步骤：

步骤1：在GNLYL-2A-GNLYS-2A的5’端引入EcoRI酶切位点，3’端引入MscI酶切位点，获得如SEQ ID No.6所示序列；

步骤2：将表达载体pIRES2-EGFP和如SEQ ID No.6所示序列的目的基因分别进行EcoRI和MscI双酶切后连接，构建获得p-GNLYL-2A-GNLYS-2A-EGFP载体。

9.根据权利要求5至7任一项所述的质粒载体在表达颗粒溶素中的应用。

10.根据权利要求5至7任一项所述的质粒载体在同时表达9kDa颗粒溶素和15kDa颗粒溶素中的应用。