[发明专利]一种筛选拳卷地钱SSR引物的方法

说明书

本发明公开一种筛选拳卷地钱SSR引物的方法，利用SAM法，对野生种拳卷地钱(Marchantia convoluta)进行SSR分子标记研究。利用改良的CTAB方法提取DNA，再经酶切、连接、抑制性PCR、预扩增、SAM法、PCR筛选拳卷地钱SSR引物。SAM法扩增结果条带清晰，筛选得到阳性克隆进行测序，得到SSR引物序列。通过PCR筛选出有效扩增的拳卷地钱SSR引物。该SSR分子标记技术可作为拳卷地钱遗传多样性研究方法。

技术领域

本发明属于遗传分子技术领域,涉及中药资源开发利用及遗传多样性研究,具体涉及一种筛选拳卷地钱SSR引物的方法。

背景技术

目前，运用分子标记对生物体进行遗传学研究已成为诞下的重点和热点，如何在众多的分子标记中选择适当方法对遗传研究的效率和成败具有决定意义。而在众多分子标记技术中，基于SSR标记特异性的扩增、良好的稳定性及重复性、能较好地反映物种的遗传结构和遗传多样性变化等特点，被视为比较理想的遗传标记方法。特别是近年在品种鉴定、地理来源鉴别研究、居群遗传研究、有效成分与遗传多样研究等当中得到应用。然而SSR标记具有种属特异性，不同物种间的SSR引物没有通用性，必须针对每个物种开发特异引物进行PCR检测。

拳卷地钱经广西中医药大学生药学专家鉴定为地钱科地钱属植物拳卷地钱(Marchantia convoluta Gao et Chang)，采自广西各地。据文献报道，关于拳卷地钱生药学鉴别研究、挥发性成分分析、黄酮类化合物研究、脂溶性成分研究、抗急性肝损伤及抗乙肝病毒药理研究及ISSR-PCR扩增体系研究均见报道，但目前未见关于SSR遗传标记研究内容。本文采用改良的CTAB法提取拳卷地钱DNA，经酶切、连接、抑制性PCR、预扩增、SAM法扩增得到预期片段，通过PCR筛选出有效扩增的拳卷地钱SSR引物，为拳卷地钱分子资源生药鉴别、资源开发利用提供了技术基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种筛选拳卷地钱SSR引物的方法，以及由此方法得到拳卷地钱SSR 引物，通过对拳卷地钱SSR引物筛选的研究，得到了拳卷地钱SSR引物30对，是一种研究拳卷地钱遗传多样性较好研究方法。采用改良的CTAB法提取拳卷地钱DNA，经酶切、连接、抑制性PCR、预扩增、SAM法扩增得到预期片段，通过PCR筛选出有效扩增的拳卷地钱SSR引物，为拳卷地钱分子资源生药鉴别、资源开发利用提供了技术基础。

本发明的技术方案如下：

一种筛选拳卷地钱SSR引物的方法，该方法首先提取拳卷地钱的基因组DNA，然后进行酶切和连接、抑制性PCR、再进行预扩增和SAM法扩增、PCR筛选出拳卷地钱SSR引物。

作为技术方案的进一步改进，以上所述的一种筛选拳卷地钱SSR引物的方法，其特征在于：所述的提取拳卷地钱的基因组DNA为采用CTAB法从拳卷地钱叶片中提取到拳卷地钱的基因组DNA样品。紫外分光光度计测定显示用改良的CTAB法提取的拳卷地钱的基因组DNA的 OD 260/OD280比值，同时经1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度。

作为技术方案的进一步改进，以上所述的一种筛选拳卷地钱SSR引物的方法，所述的酶切、连接为用限制性内切酶Mse I和Pst I对拳卷地钱的基因组DNA样品进行双酶切和连接，得到拳卷地钱DNA酶切和连接产物，拳卷地钱DNA酶切和连接产物的1％琼脂糖凝胶电泳检测，其片段大小为100-1500bp。

作为技术方案的进一步改进，以上所述的一种筛选拳卷地钱SSR引物的方法，所述的预扩增为将拳卷地钱DNA酶切和连接产物进行预扩增，得到预扩增产物，所述的预扩增条件为： Takara Ex Taq 1U；10×Ex Taq Buffer 2μl；稀释好的suppression PCR产物1μl；25mMMgC12 1.5μl；dNTP Mix(各2.5mM)1.5μl；Mse I adapter Primer 1 5pmol；Pst Iadapter primer 5pmol；ddH20至20μl；其中：