[发明专利]一种筛选拳卷地钱SSR引物的方法

权利要求书

1.一种筛选拳卷地钱SSR引物的方法，其特征在于：该方法首先提取拳卷地钱的基因组DNA，然后进行酶切和连接、再进行预扩增和SAM法扩增、PCR筛选出拳卷地钱SSR引物。

2.根据权利要求1所述的一种筛选拳卷地钱SSR引物的方法，其特征在于：所述的提取拳卷地钱的基因组DNA为采用CTAB法从拳卷地钱叶片中提取到拳卷地钱的基因组DNA样品。

3.根据权利要求2所述的一种筛选拳卷地钱SSR引物的方法，其特征在于：所述的酶切、连接为用限制性内切酶Mse I和Pst I对拳卷地钱的基因组DNA样品进行双酶切和连接，得到拳卷地钱DNA酶切和连接产物，拳卷地钱DNA酶切和连接产物的1％琼脂糖凝胶电泳检测，其片段大小为100-1500bp。

4.根据权利要求3所述的一种筛选拳卷地钱SSR引物的方法，其特征在于：所述的预扩增为将拳卷地钱DNA酶切和连接产物进行预扩增，得到预扩增产物，所述的预扩增条件为：Takara Ex Taq 1U；10×Ex Taq Buffer 2μl；稀释好的suppression PCR产物1μl；25mMMgC12 1.5μl；dNTP Mix(各2.5mM)1.5μl；Mse I adapter Primer 1 5pmol；Pst Iadapter primer 5pmol；ddH20至20μl；其中：

Mse I adapter primer 1的序列：5'-GAC GAC CGA CGA GTA AC-'3

Pst I adapter primer 的序列：5'-AGA CTG CGT ACA TGC AGG A-'3。

5.根据权利要求4所述的一种筛选拳卷地钱SSR引物的方法，其特征在于：所述的SAM法扩增是将预扩增产物在反应体系为：10×Ex Taq Buffer 2μl；稀释好的预扩增产物2μl；Takara Ex Taq lU；25mM MgCl2 1.5μl；dNTP Mix(各2.5mM)1.5μl；Mse I adapter primer3(4～10)5pmol；SSR primer(PCT6)20pmol；加ddH20至20μl，的条件下进行SAM扩增，得到SAM扩增产物。

6.根据权利要求5所述的一种筛选拳卷地钱SSR引物的方法，其特征在于：所述的SAM法扩增还包括SAM扩增产物的回收与克隆，所述的SAM扩增产物的回收与克隆为：通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳将SAM扩增产物分离，随机挑选200个大小不同的SAM扩增片段，枪头压碎并用双蒸水浸泡离心，进行第二次SAM扩增，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳纯化，DNA纯化试剂盒回收，回收产物通过与PMD18-TVector的连接，转入感受态细胞，经Amp+LB平板筛选得到阳性克隆，随机从每个平板上挑选2个白色菌落，共克隆得到了100个SAM片段用于测序。

7.根据权利要求6所述的一种筛选拳卷地钱SSR引物的方法，其特征在于：所述的PCR筛选为：根据测序得到的DNA片段中所含的SSR的侧翼序列采用Primerpremier5.0软件设计特异引物，从86个片段中根据SSR位点的一侧或两侧序列设计特异引物进行合成，然后与5′锚定兼并引物SSRprimer(PCT6)组成引物对，以拳卷地钱的基因组DNA为模板，经2％的琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出30对清晰条带的特异引物，即为拳卷地钱SSR引物。

8.根据权利要求2所述的一种筛选拳卷地钱SSR引物的方法，其特征在于：所述的PCR筛选为：所述的取到拳卷地钱的基因组DNA样品后，还包括用紫外分光光度计测定显示用拳卷地钱的基因组DNA的OD260/OD280比值，同时经1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度。