[发明专利]羧酸酰胺类杀菌剂抗性基因作为卵菌转化筛选标记的应用

说明书

本发明涉及基因工程领域，具体公开了羧酸酰胺类杀菌剂抗性基因作为卵菌转化筛选标记的应用。本发明通过将可引起卵菌对羧酸酰胺类杀菌剂产生100倍以上抗性的突变蛋白的编码基因作为筛选标记，用于卵菌转化时转化子的筛选，该筛选标记的开发能够在一定程度上解决辣椒疫霉遗传转化时筛选标记单一等问题，有助于辣椒疫霉基因功能的研究。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种新型的卵菌转化筛选标记。

背景技术

辣椒疫霉属于藻界(Kingdom Chromista)、卵菌门(Phylum Oomycota)、卵菌纲(Class Oomycetes)、霜霉目(Order Peronosporales)、霜霉科(FamilyPeronosporaceae)、疫霉属(Genus Phytophthora)(Lamour et al.,2012)，该病原引起的辣椒疫病潜育期短、发展迅速，是辣椒生产上的毁灭性病害之一。1918年，辣椒疫病的爆发给智利的辣椒生产造成了严重的经济损失，随后，1922年该病首次在新墨西哥报道(Leonian,1922)，目前该病害在世界各地广泛发生。辣椒疫病的发病症状与辣椒品种、侵染部位及环境条件息息相关，通常该病害在高温高湿条件下发生较为严重。辣椒疫霉侵染辣椒后主要症状表现为根茎部变褐、腐烂或缢缩，叶部出现暗绿色水渍状病斑，植株萎蔫，湿度较大时在发病果实表面形成白色霉层(Hausbeck et al.,2004)。辣椒疫病一般发病率在5％-65％，发病严重时可使辣椒减产80％，甚至绝收(张振兵等,2006)。辣椒在全生育期的不同部位包括茎、叶和果实均可受到辣椒疫霉的侵染(刘志恒，2003)。另外，辣椒疫霉寄主广泛，至少可侵染包括茄科、葫芦科等在内的26科的植物(Kamoun et al.,2015；Granke etal.,2012)。

目前辣椒疫病的防治仍以化学防治为主，羧酸酰胺类(CAA类)杀菌剂是防治该病害的一类重要杀菌剂，其代表药剂包括氟吗啉、烯酰吗啉、异丙菌胺和双炔酰菌胺等。该类杀菌剂的作用机理是抑制卵菌的细胞壁合成，其在卵菌体内的作用靶标是纤维素合酶3(CesA3)。辣椒疫霉纤维素合酶3的突变可引起该菌对CAA类杀菌剂产生抗药性，其中该靶标蛋白第1105位(甘氨酸1105丙氨酸)和1109位(缬氨酸1109亮氨酸)同时突变可造成辣椒疫霉对上述4种CAA类杀菌剂均产生高倍抗药性，其抗性倍数在100倍以上(陈磊,2013)。

卵菌CRISPR/Cas9基因敲除体系首先成功在大豆疫霉中建立(Fang and Tyler,2016)，该体系亦可用于辣椒疫霉的基因功能研究。但是目前辣椒疫霉遗传转化时可利用的筛选标记仅限于具有遗传霉素(G418)抗性的NPTⅡ基因，这严重制约了辣椒疫霉基因回补及多敲除等工作的开展。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种新型的卵菌转化筛选标记——羧酸酰胺类杀菌剂抗性基因RCesA3，以及其作为卵菌转化筛选标记，在进行卵菌转化时的应用。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供一种羧酸酰胺类杀菌剂抗性基因作为卵菌转化筛选标记的应用。

其中，所述羧酸酰胺类杀菌剂抗性基因编码辣椒疫霉中靶标蛋白RCesA3，使其相对于野生型蛋白CesA3，在第1105位发生氨基酸的突变，由甘氨酸突变为丙氨酸，同时，在第1109位发生氨基酸的突变，由缬氨酸突变成亮氨酸。

本发明将该抗性基因(也可称为抗性标记基因)作为新型的卵菌转化筛选标记RCesA3。

所述羧酸酰胺类杀菌剂抗性基因具体可为如下1)或2)或3)的DNA分子：

1)如SEQ ID NO.1所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列重组且编码与羧酸酰胺类杀菌剂抗性相关蛋白，并可引起卵菌对羧酸酰胺类杀菌剂产生100倍以上抗性的DNA分子；