[发明专利]羧酸酰胺类杀菌剂抗性基因作为卵菌转化筛选标记的应用

权利要求书

1.羧酸酰胺类杀菌剂抗性基因作为辣椒疫霉转化筛选标记的应用，其特征在于，所述羧酸酰胺类杀菌剂抗性基因具体为如SEQ ID NO.1所示的DNA分子；

所述应用具体为：将所述羧酸酰胺类杀菌剂抗性基因连入含有来自莴苣霜霉的启动子Ham34的转化载体，用于辣椒疫霉遗传转化时转化子的筛选；

所述筛选为以其他筛选标记基因获得的敲除转化子的基因回补实验中的筛选，或用于辣椒疫霉以其他筛选标记基因获得的敲除转化子的其他基因的再敲除的转化筛选；

其中，筛选阳性转化子的方法具体为：

18℃黑暗条件下使原生质体再生1天，以含有杀菌剂氟吗啉的PM固体培养基筛选转化子，25℃黑暗条件下培养3天，在有菌丝长出的PM固体培养基上覆一层含有氟吗啉的V8固体培养基，进行第二次筛选，继续在25℃黑暗条件下培养3天，待菌落长出后将菌落转接至含有氟吗啉的V8平板，进行第三次筛选；

筛选转化子时氟吗啉在培养基中的浓度介于6-12μg/mL之间。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：

S1、以传统的筛选标记NPTⅡ基因为筛选标记，以遗传霉素G418进行转化子的筛选，将辣椒疫霉的靶标基因替换为外源基因NPTⅡ，获得靶标基因被敲除的转化子；

S2、根据NPTⅡ基因，设计靶向NPTⅡ基因的sgRNA表达载体；

S3、将所述羧酸酰胺类杀菌剂抗性基因连入上述sgRNA表达载体，得到带有羧酸酰胺类杀菌剂抗性基因的sgRNA表达载体；

S4、以S1所述的靶标基因被敲除的转化子为实验材料，获得原生质体，通过PEG-CaCl₂介导的方法向原生质体中同时转入带有羧酸酰胺类杀菌剂抗性基因的sgRNA表达载体、Cas9蛋白表达载体和同源臂载体；经筛选获得阳性转化子。

3.一种辣椒疫霉转化的筛选方法，其特征在于，以羧酸酰胺类杀菌剂抗性基因作为筛选标记连入含有来自莴苣霜霉的启动子Ham34的转化载体，进行辣椒疫霉转化时转化子的筛选；

所述羧酸酰胺类杀菌剂抗性基因具体为如SEQ ID NO.1所示的DNA分子；

所述筛选为以其他筛选标记基因获得的敲除转化子的基因回补实验中的筛选，或用于辣椒疫霉以其他筛选标记基因获得的敲除转化子的其他基因的再敲除的转化筛选；

其中，筛选阳性转化子的方法具体为：

18℃黑暗条件下使原生质体再生1天，以含有杀菌剂氟吗啉的PM固体培养基筛选转化子，25℃黑暗条件下培养3天，在有菌丝长出的PM固体培养基上覆一层含有氟吗啉的V8固体培养基，进行第二次筛选，继续在25℃黑暗条件下培养3天，待菌落长出后将菌落转接至含有氟吗啉的V8平板，进行第三次筛选；

筛选转化子时氟吗啉在培养基中的浓度介于6-12μg/mL之间。