[发明专利]对虾传染性肌肉坏死病毒（IMNV）的RAA恒温荧光检测方法及试剂

说明书

本发明公开了一种对虾传染性肌肉坏死病毒（IMNV）RAA恒温荧光检测方法和检测试剂盒。检测试剂盒包括一条正向引物SEQ ID NO.1、一条反向引物SEQ ID NO.2、一条特异性荧光探针SEQ ID NO.3、反应液、逆转录酶、重组聚合酶和对照品。本发明的试剂盒特异性强；检测灵敏度高，可达到0.10fg/μL；准确度高、可靠；操作简便快捷，适合现场检测，具有广泛的应用场景。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及海洋水产养殖业的检测方法，具体涉及一种对虾传染性肌肉坏死病毒的RAA恒温荧光检测方法及试剂盒。

背景技术

对虾传染性肌肉坏死病毒(infectious myonecrosis virus，IMNV)是一种双链RNA病毒，直径40nm，二十面体，无囊膜；长度7560bp，包括2个开放阅读框(ORF1，ORF2)，其中ORF1编码一个RNA结合蛋白和一个衣壳白，ORF2编码一个由736个氨基酸组成的依赖于RNA的RNA聚合酶。2002年首次爆发于巴西。IMNV主要感染凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)，病毒可感染成虾、仔虾以及苗种，主要感染60～80日龄的幼虾。该病毒破坏全身肌肉组织，但病程缓慢，死亡率不高，严重时累计死亡率可达70％～85％。2006年，该病被亚太地区水产养殖发展网络中心(Net work of Aquaculture Centres in Asia-Pacific，NACA)和联合国粮农组织(Food and Agriculture Organization of the UnitedNations，FAO)列入亚太地区水生动物监测季度报告(QAAD)的病害监测名录。2007年，被国际兽疫局(The World Organisation for Animal Health，OIE)列入需要报告的水生动物病毒性疫病[8]。我国农业部于2008年12月11日发布的第1125号公告也将其列入二类动物疫病多种动物共患病中的甲壳类病。

目前对IMNV引起的对虾病害尚无有效的治疗方法，只能以预防为主；而这又主要依赖于早期快速的诊断和筛查。近年来基于临床组织病理学、免疫学以及PCR技术等的各种诊断方法已被用于IMNV的检测。但是现有的这些方法都存在一定的不足，例如：基于组织病理学的方法不仅操作繁琐、费时，而且灵敏度较低；基于免疫学的方法虽然具有敏感性高、检测快速等特点，可用于大批标本的检测，但对新鲜样品进行检测时出现的假阳性问题在一定程度上还限制着该方法的广泛应用；而PCR方法敏感、准确、快速，可替代病原学检测，但由于需要昂贵的仪器设备、较高检测费用以及对检测人员较高的技术要求而使其不适用于现场快速检测及基层普及应用。与一般PCR技术相比，荧光PCR检测技术简化了操作步骤，而且可消除扩增产物引起的交叉污染，减少假阳性的发生。但实时荧光PCR耗时长，成本较高，目前在水产养殖动物的常规病原体检测中的应用还不多。LAMP等温扩增技术同样由于假阳性较高，准确度低，水产病原检测中的应用还是比较局限。本发明建立了RAA恒温荧光来检测虾桃拉病毒的方法，快速方便，准确可靠，是适应口岸快速检测和大通关的时代要求，对促进中国海洋养殖及其产品的贸易有重要作用。

重组酶介导扩增(Recombinase-aid Amplification，RAA)技术也是一种在恒温下可以使核酸快速扩增的方法。与RPA不同的是，RAA扩增法使用的是从细菌或真菌中获得的重组酶，在37℃恒温下，该重组酶可与引物DNA紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全互补的序列时，在单链DNA结合蛋白(single-strandedDNAbinding，SSB)的帮助下，使模板DNA解链，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，反应产物也是以指数级增长，通常在1h内即能得到可以用琼脂糖凝胶电泳检测到的扩增片段。在RAA反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个RAA扩增过程，20分钟内，可实现对起始模板的定量及定性分析。整个反应简单快速，因为不需要高温循环，所以特别适合在有大量样品的非实验室检测场所使用，适用于食品快速检测领域。

发明内容