[发明专利]编程式的核酸恒温扩增方法及其试剂盒应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域中核酸分子生物学检测方法，具体的涉及编程式的核酸恒温扩增方法及其试剂盒应用。

背景技术

根据世界卫生组织对全球的流行病趋势调查研究表明，以往常规的病原菌检测方法(例如细菌培养、外部形态结构和生理生化鉴定以及血清学鉴定等)由于其耗时费力、步骤繁琐和对仪器设备的依赖等不足，已经无法有效的满足人类对致病微生物进行快速和特异检测的要求。分子生物学技术的快速发展，使得人们可以从分子水平来对目前常规检测手段难以检测的病原微生物进行快速/正确地鉴定，极大的提高病原菌的检测水平，并对传染病传播的起到了良好的控制效果。目前，高度敏感、高度特异的核酸扩增技术可以直接在不需要对病原微生物进行分离培养的基础上直接用于临床标本的检测，并能在较短时间内(2-3小时)得出结果，在感染性疾病的诊断中应用越来越广泛。这些分子检测技术与其他分子生物学技术以及生物信息学手段结合，正向快速朝着准确、快速、灵敏以及自动化的方向发展。

目前的核酸检测技术根据扩增过程中对温度的要求可以分为两类：

1.在扩增中依赖于温度循环往复变化的扩增技术，如聚合酶链反应(PCR) 和连接酶链式反应(1igase chain reaction，LCR)。PCR/LCR反应的每一循环都包括模板变性，引物复性和引物的延伸/连接反应。每次循环新合成的DNA 片段又可成为下次循环的模板，这就可以使靶序列DNA数量能指数扩增的方式增加。其中PCR技术是目前最成熟的核酸扩增技术，并已经得到了极为广泛的应用和发展。但是，普通的PCR技术需要专门的仪器，而且还存在容易交叉污染和操作过程繁琐的缺点。而荧光实时PCR(real-time PCR)虽然能比较好的解决了交叉污染的问题，并简化了相应的操作步骤，但是其却需要复杂昂贵的定量扩增仪器。这些缺点限制了其在现场检测事件和基层社区医院的推广和应用。

2.核酸恒温扩增系统是指核酸扩增过程中只在一个恒定温度的条件下进行，并不需要通过循环往复的对反应液体进行升温降温过程。目前比较常见的技术如链置换扩增技术(strand displacement amplification，SDA)，核酸序列扩增技术(NucleicAcid Sequence Based Amplification,NASBA)，转录酶扩增技术(Transcription Mediated Amplification,TMA)，滚环扩增技术(Rolling Circle Amplification,RCA)，连环恒温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)，解链酶扩增技术(Helicase Dependent Amplification, HDA)，和交叉引物扩增技术(Cross Priming Amplification,CPA)等。这些技术除了高特异性和高灵敏度外，相对PCR技术而言，操作简单，对仪器设备的要求低往往一台水浴锅甚至简易的保温杯即能有效实现扩增反应；同时检测结果的判读也比较简单，如LAMP的反应结果可以通过肉眼观察白色浑浊或者绿色荧光的生产进行有效的判断，简便快捷，因此适合现场检测以及在基层医疗单位的推广使用。

核酸恒温扩增技术根据所参与的酶参与的数量的多少又可以大致的分为单酶体系(如LAMP和CPA)以及多酶体系(如RCA，TMA，HAD等)。 LAMP是目前应用最广泛的单酶恒温扩增体系，其扩增体系中主要包括Bst 大片段DNA聚合酶和两对特殊的内引物(FIP由F1C和F2组成；BIP由BIC 和B2组成)、一对外引物(F3和B3)组成。FIP引物的F2序列与靶DNA上互补序列配对，启动循环链置换反应。F3引物与模板上的F3C区域互补，引起合成与模板DNA互补的双链，从而挤掉FIP引起的DNA单链。与此同时， BIP引物与被挤掉的这条单链杂交结合，形成的环状结构被打开，接着B3引物在BIP外侧进行碱基配对，在聚合酶的作用下形成新的互补链。被置换的单链DNA两端均存在互补序列，从而发生自我碱基配对，形成类似哑铃状的 DNA结构。LAMP反应以此DNA结构为起始结构，进行再循环和延伸，靶 DNA序列大量交替重复产生，形成的扩增产物是有许多环的花椰菜形状的茎一环结构的DNA。

本发明涉及一种新型的核酸恒温扩增方法，其特点是针对靶基因的不同区域设计不同的引物，然后在具有链置换功能的DNA聚合酶的作用下完成核酸扩增过程。其扩增产物可以通过在反应中加入特异性的荧光染料直接进行可视化检测或者在相关的仪器上进行实时检测。

发明内容