[发明专利]一种基于移除野生型序列的低丰度基因突变富集方法

说明书

本发明公开了一种基于移除野生型序列的低丰度基因突变富集方法，本发明方法在PCR扩增前对用作DNA模板的样品DNA进行处理，使3'末端被封闭的含突变位点的核苷酸单链作为杂交链与野生型和突变型序列杂交，双链特异性核酸酶能特异性地移除杂交链与野生型序列形成的完全互补配对的同源双链DNA，但不能移除杂交链与突变型序列形成的非完全互补的异源双链DNA。移除后的产物经PCR扩增，PCR扩增所用的一条引物3'末端位于突变位点上且被封闭，在具有3'‑5'校读活性的聚合酶作用下，使野生型序列不能扩增，但突变型序列得以指数扩增，由此有效富集低丰度基因突变序列，提高了富集灵敏度和准确度，同时本发明方法还可以同时富集多种突变型序列从而提高扩增效率。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于移除野生型序列的低丰度基因突变富集方法。

背景技术

人类基因组计划的完成推动了基因突变研究的快速发展。近年来，“精准医疗”计划的提出更进一步使基因突变及其检测方法研究成为生物学研究和临床精准医疗的热点和基础。随着检测技术的不断发展，研究人员发现大多数基因突变表现为低丰度(含量从0～100％)，并且这些低丰度基因突变在医学和生物学等领域具有重要的研究意义。不断出现的新方法和技术为低丰度基因突变的富集提供了可靠的前景，这些技术大部分基于PCR技术原理。PCR即聚合酶链式反应，是一种用于扩增特定DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，能将微量的DNA大幅增加。PCR反应体系主要包括五种试剂即引物、DNA聚合酶、dNTP、模板和缓冲液(其中需要Mg²⁺)，PCR反应步骤主要包括预变性、变性、退火和延伸，其中变性、退火和延伸3步的循环运行为核心步骤。变性即通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA；退火即当温度突然降低时，由于模板分子结构较引物要复杂得多，而且反应体系中引物DNA量大多于模板DNA，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA双链之间互补的机会较少；延伸即在DNA聚合酶和4种dNTP底物及Mg²⁺存在的条件下，5'→3'的DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应，变性、退火和延伸3步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，数小时之后，介于两个引物之间的特异性DNA片段得到了大量复制，数量可达2×10^6～7拷贝。目前，已经报道了在PCR扩增之前、之中或之后减少野生型序列的方法，但是这些方法通常适用于单个PCR扩增子，或仅适用于序列特异性酶能识别的少数DNA靶标。另外，PCR扩增过程可能引入由碱基错配导致的假阳性，导致基因突变很难和假阳性信息区分开来。近年来，随着高通量技术的出现，移除样本中大量野生型DNA序列的需求日益增加，例如高通量测序文库制备之前移除大量野生型DNA。通常高通量测序无法检测丰度低于～2％的DNA突变，采用移除大量野生型DNA序列的方法能有效富集低丰度突变型序列以期提高测序检测限。本发明提供一种基于移除野生型序列的低丰度基因突变富集方法，该方法能同时扩增多个PCR扩增子，而且野生型序列移除是在PCR扩增反应前进行的，它能有效避免PCR扩增过程碱基错配导致的假阳性，而且本发明中PCR扩增过程通过引入一条引物3'末端位于突变位点上且被封闭，在具有3'-5'校读活性的聚合酶作用下，野生型序列与该引物完全互补而不能继续延伸，而突变型序列由于最后一个错配使错配碱基被切除而继续延伸，使突变型序列进一步得以富集。该方法简单、准确度高，可应用于医学和生物学的许多领域，以推动个体化医疗的发展。

发明内容

鉴于此，本发明提供一种基于移除野生型序列的低丰度基因突变的富集方法，操作简单且准确性更好的富集方法，能同时扩增多个PCR扩增子，且有效避免PCR扩增低丰度突变基因过程中的假阳性问题。

本发明采用的技术方案是：