[发明专利]一种采用响应面法快速优化金属离子促进芽孢杆菌产孢的方法

说明书

本发明提供了一种采用响应面法快速优化金属离子促进芽孢杆菌产孢的方法，包括以下步骤：以芽孢DPA荧光强度为响应值，首先采用单因子试验设计对可能影响到芽孢发酵的金属离子进行筛选，选取离子浓度改变时对荧光强度产生显著增强的金属离子类型及其最适的添加浓度。进一步采用中心组合设计，同样以芽孢DPA荧光强度为响应值，通过响应面统计分析确定金属离子的组合效应，实现在一定的离子浓度组合情况下芽孢产量的最大化。本发明提供的方法能够大大降低芽孢发酵过程中试验设计检测的工作强度，缩短试验周期，确保试验准确性，提高设计效率。

技术领域

本发明具体涉及一种采用响应面法快速优化金属离子促进芽孢杆菌产孢的方法，属于微生物发酵工程技术领域。

背景技术

芽孢杆菌是一类耗氧或者兼性厌氧的革兰氏阳性杆菌，因其产生抗逆性的芽孢而使其成为一类特别的微生物类群。因其稳定性很强，并且能够在人和动物胃肠道存活并萌发代谢，作为活的微生物添加剂现已广泛用于人类医药、动物饲料中，对于保障机体健康，调节肠道微生物平衡，增加免疫力等方面具有积极作用。

与其他非芽孢微生物不同，芽孢杆菌的芽孢是营养细胞生长到后期产生的一个休眠体，因其生长环境中营养缺乏、细胞累积等因素而大量产生。同时也会受到培养基或者发酵条件中的金属离子浓度、碳氮源的组成、氧的供给等因素影响。作为一种微生物活菌制剂，在工业化生产时，既需要控制条件使得其发酵环境中芽孢最大限度的积累，又需要尽可能降低生产成本，从而实现工业生产和应用利润的最大化。

已有研究表明，一些金属离子对于某些芽孢杆菌芽孢的形成具有显著影响，在芽孢发酵培养基中添加合适的金属离子可以有效提高芽孢含量。因此，通过优化选择金属离子类型及其添加浓度为芽孢的发酵产量提高提供了一种可靠途径。

现在很多的生物发酵研究都是采用的统计软件精心构建高效实验设计来进行微生物发酵的优化，这种优化方法在较少的试验次数的基础上采用数学模拟和优化，大大简化了试验步骤，还提高了准确性。但对于芽孢的发酵而言，通常也都是采用平板计数的传统方法来测定芽孢浓度作为试验设计的响应值。以一次4因素的响应面设计为例，如果中心点采用三次重复，往往最少需要27次试验，为了确保实验设计的可靠性，另需要2次重复，这样基本上就需要54次平行试验的芽孢测试结果。平板计数时，又需要最少采用三个稀释度，每个稀释度要3个平行，这样就需要一次性涂琼脂平板486个。因此工作量巨大，又要求同步完成，培养周期长，人为因素误差较大，这些因素对芽孢优化设计造成了巨大障碍，试验结果的准确性难以得到保证。因此，探索一种简单反应芽孢浓度的方式并用于其芽孢生产的优化设计的方法，对于芽孢类的生物制剂生产具有重要意义。

发明内容

在芽孢杆菌的芽孢发酵生产中，为提高芽孢发酵浓度，降低生产成本，需要根据不同菌株的特点进行营养和生产条件优化。在优化设计过程中，针对传统的芽孢平板定量计数方法工作量大、耗时长的特点，为了增强芽孢杆菌发酵代谢转化芽孢的能力，提高在发酵优化时试验设计的效率，本发明提供了一种采用响应面法快速优化金属离子促进芽孢杆菌产孢的方法，以为芽孢类的生物制剂工业化生产奠定基础。

实现本发明上述目的所采用的技术方案为：

一种采用响应面法快速优化金属离子促进芽孢杆菌产孢的方法，包括以下步骤：

(1)单因子试验设计：在基础培养基的基础上，分别选取不同的可能对芽孢生成起到促进作用的金属离子，分别改变其在发酵液中的最终摩尔浓度，经过36h-60h发酵培养后，用移液器取其芽孢悬液1毫升，洗涤该芽孢悬液，用于芽孢DPA荧光强度的检测；

(2)芽孢悬液的处理及荧光检测：芽孢悬液采用诱导芽孢萌发的方法促进重悬液中芽孢清液经过一定程度稀释后测定其荧光强度；将上清液稀释后与EuCl₃和环己二胺四乙酸充分混合均匀，采用荧光分光光度计测定上述混合溶液的荧光强度，测定过程中激发波长范围 260～280nm，发射波长范围610～630nm；