[发明专利]一种采用响应面法快速优化金属离子促进芽孢杆菌产孢的方法

权利要求书

1.一种采用响应面法快速优化金属离子促进芽孢杆菌产孢的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）单因子试验设计：在基础培养基的基础上，分别选取不同的可能对芽孢生成起到促进作用的金属离子，分别改变其在发酵液中的最终摩尔浓度，经过36 h-60 h发酵培养后，用移液器取其芽孢悬液1毫升，洗涤该芽孢悬液，用于芽孢DPA荧光强度的检测；

（2）芽孢悬液的处理及荧光检测：将芽孢悬液洗涤后重悬，采用诱导芽孢萌发的方法促进重悬液中芽孢体内的DPA的完全释放，离心后收集上清，对上清液用Tris-HCl缓冲液进行一定比例的梯度稀释，测定其荧光强度；将上清液稀释后与EuCl₃和环己二胺四乙酸充分混合均匀，采用荧光分光光度计测定上述混合溶液的荧光强度，测定过程中激发波长范围260~280 nm，发射波长范围610~630 nm；

（3）显著性因子的筛选：以芽孢DPA荧光强度为响应值，对单因子试验设计中能影响到芽孢发酵的金属离子进行筛选，选取离子浓度改变时对荧光强度产生显著增强的金属离子类型及其最适的添加浓度；

（4）采用中心组合设计，确定金属离子的组合效应，实现在一定的离子浓度组合情况下芽孢产量的最大化：根据单因子试验设计的实验结果，以显著正效应的金属离子及其最大荧光强度效应时的浓度作为响应面优化实验因素的中心点，采用统计软件Box-Benhnken设计或者中心组合设计进行实验设计，以芽孢释放产生的DPA荧光强度作为响应值，对响应面模型进行方差分析，确定离子组合效应及对芽孢发酵产生的DPA荧光强度最大值；

所述芽孢杆菌为解 淀粉芽孢杆菌B. amyloliquefaciens BS-20，所述解淀粉芽孢杆菌B. amyloliquefaciens BS-20 已于2017 年10 月17 日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC： M 2017587，分类命名为解淀粉芽孢杆菌BS-20（BacillusAmyloliquefaciensBS-20）。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中该芽孢悬液的洗涤包括：将移取的1毫升芽孢悬液于6000rpm下离心10分钟后，用缓冲液重悬到该缓冲液中再于6000rpm下离心10分钟，重复上述的重悬、离心步骤。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中芽孢悬液芽孢萌发的方法为物理方法，具体为灭菌、微波处理或超声破碎；或者为化学诱导剂混合培养法，所述化学诱导剂具体为肌苷、L-丙氨酸、溶菌酶或吡啶二羧酸钙。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述诱导芽孢萌发的方法具体为高温高压灭菌法，包括：将重悬液置于密闭容器中，然后置于高压灭菌锅内在不低于100℃的温度下处理10分钟以上。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述化学诱导剂混合培养法包括：用100mM的诱导剂在200rpm下振荡3 h以上，悬浮芽孢以制成芽孢悬液。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：步骤（2）中稀释后的上清液、EuCl₃和环己二胺四乙酸三者的体积比为1：4.5：4.5；其中EuCl₃和环己二胺四乙酸均采用缓冲液配制成浓度为2 mM。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤（2）中荧光强度检测条件参数为：扫描速度3000 nm/min，EX狭缝10.0 nm，EM狭缝5.0 nm，光电倍增管电压700 V，响应0.08 s。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤（4）中所采用的统计软件为DesignExpert、JMP或Statistica软件。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤（1）~（4）中，所述的缓冲液为50 mmol/L，pH 8.0的Tris-HCl缓冲液；所述的金属离子包括铜离子、铁离子、钙离子、锰离子和镁离子。