[发明专利]一种鸽TTV实时荧光定量PCR检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种鸽TTV实时荧光定量PCR检测试剂盒，属于动物病毒学领域。

背景技术

输血传播病毒，又称Torque teno virus (TTV)，根据国际病毒分类委员会ICTV最新分类，将其归类于指环病毒科(Anelloviridae)，α细环病毒属(Alphatorquevirus)。TTV是一类无囊膜、单链环状DNA病毒，研究发现不同种属的TTV病毒基因组长短不一。人源TTV的基因组为3.2kb～3.9kb，猪和犬类的基因组为2.8kb左右，而猫科TTV的基因组约为2.1kb。对TTV的分析发现，TTV基因组有编码区和非编码区组成。一般认为，TTV包含有2个大的开放阅读框（ORFs）：ORF1和ORF2，分别编码复制相关蛋白（Rep）和抗原相关蛋白（Cap）。

鸽感染TTV最早于2013年报道（Zhang Z, Zhuang L, Dai W, Mao H, Dai D.Complete genome sequence of a novel pigeon torque teno virus in China. Genome Announc, 2013, 1(6). pii: e01076-13.）。目前，由于鸽TTV无法分离培养，关于鸽TTV致病力、致病机理等相关研究较少。建立检测鸽TTV的实时荧光定量PCR检测引物及其试剂盒，可为对开展鸽TTV的相关致病机理研究和流行病学调查奠定研究基础。

实时荧光定量PCR方法（Real time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系。荧光探针法是用序列特异的荧光标记探针来检测产物，探针法的出现使得定量PCR技术的特异性比常规PCR技术大大提高。目前较常提及的有TaqMan探针、FRET杂交探针(荧光共振能量传递探针)和分子信标（molecular Beacon）。TaqMan探针法是指PCR扩增时在加入一对引物的同时另外加入一个特异性的荧光探针，该探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有荧光报告基团，如FAM、VIC、JOE等，3′端标记有荧光淬灭基团，如Eclipse、TAMRA等。当探针完整的时候，5′端报告基团经仪器光源激发的荧光正好被近距离的3′端荧光基团淬灭，仪器检测不到5′端报告基团所激发的荧光信号(就是说5’荧光基团的发射波长正好是3’ 荧光基团的吸收波长，因而能量被吸收传递到3’荧光基团而发出其它荧光)。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′-3′外切酶活性(此活性是双链特异性的，游离的单链探针不受影响)就会切割探针，释放5′端报告基团游离于反应体系中，远离3′端荧光淬灭基团的屏蔽，5′端报告基团受激发所发射的荧光信号就可以被探头检测到。也就是说每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，报告信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。当前国内外尚未见实时荧光定量PCR检测鸽TTV引物、探针及其方法相关研究报道，本发明的建立可填补国内外相关领域空白。

发明内容

本发明的目的是填补现有尚未见实时荧光定量PCR检测鸽TTV的引物和探针的方法相关研究报道空白，提供一种鸽TTV实时荧光定量PCR检测试剂盒及其使用方法。该方法灵敏度高、稳定性好、特异性强、重复性好，最低可检测49.3个拷贝/μL，可用于对临床样本中鸽TTV的分子流行病学调查，为明确鸽TTV的分子流行病学特点提供检测方法和手段。

为实现上述目的，采用以下技术方案：

一种鸽TTV实时荧光定量PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括于1对引物和探针，引物序列为：

上游引物PiTTV-F：5’-CAAGGTATTCAACAAGTTAC -3’；

下游引物PiTTV -R：5’- TGTGGGATTCCTGAATAG -3’；

所述探针序列PiTTV-P为： 5’- AACAGCTTGACCATTCCACGG -3’，其5’-端标记荧光报告基团FAM，3’-端标记荧光淬灭基团Eclipse。