[发明专利]用于检测鸽TTV的EvaGreen实时荧光定量PCR引物及试剂盒

说明书

技术领域

本发明提供用于检测鸽TTV的EvaGreen实时荧光定量PCR引物及试剂盒，属于动物传染病学领域。

背景技术

实时荧光定量PCR方法（Real time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系。当前，实时荧光定量的在非特异性荧光标记中，荧光染料包括饱和荧光染料和非饱和荧光染料，分别为：不饱和染料（主要是SYBR GreenⅠ）和饱和染料（主要是EvaGreen）有两种常用的荧光染料。前期研究发现，EvaGreen对实时荧光定量PCR的抑制性远小于 SYBR Green I ，故EvaGreen 既可用于多重 PCR ，也可用于高分辨率（高清晰）熔解曲线分析（HRM），该分析正被越来越多的用于实时荧光定量PCR后的基因分型和异源双链分析。此外，EvaGree稳定性极强，且因其对细胞膜透性较低，而较SYBR GreenⅠ更加安全。

输血传播病毒，又称Torque teno virus (TTV)，根据国际病毒分类委员会ICTV最新分类，将其归类于指环病毒科(Anelloviridae)，α细环病毒属(Alphatorquevirus)。TTV是一类无囊膜、单链环状DNA病毒，研究发现不同种属的TTV病毒基因组长短不一。人源TTV的基因组为3.2kb～3.9kb，猪和犬类的基因组为2.8kb左右，而猫科TTV的基因组约为2.1kb。对TTV的分析发现，TTV基因组有编码区和非编码区组成。一般认为，TTV包含有2个大的开放阅读框（open reading frame，ORFs）：ORF1和ORF2，分别编码复制相关蛋白（Rep）和抗原相关蛋白（Cap）。

鸽感染TTV最早于2013年报道（Zhang Z, Zhuang L, Dai W, Mao H, Dai D. Complete genome sequence of a novel pigeon torque teno virus in China. Genome Announc, 2013, 1(6). pii: e01076-13.）。目前，由于鸽TTV无法分离培养，关于鸽TTV致病力、致病机理、分子流行病学调查等相关研究还未见涉及。建立能够对鸽群鸽TTV的实时荧光定量PCR检测方法，可有效用于对鸽群中流行的鸽TTV病原进行检测。但是，当前国内外尚未见基于饱和荧光染料Eva Green可对鸽TTV进行检测实时荧光定量PCR检测方法的引物研究报道，本发明的建立可填补国内外相关领域研究空白。

发明内容

本发明提供用于检测鸽TTV的EvaGreen实时荧光定量PCR引物及试剂盒, 建立能够对鸽群中鸽TTV检测的EvaGreen实时荧光定量PCR方法，简化操作程序、节约成本。

为实现上述目的，采用以下技术方案：

鸽TTV EvaGreen实时荧光定量PCR检测引物，包括如下：

上游引物PiTTV-SYF1：5’- TTATGAGACGGCAGCTCTGGC -3’，

下游引物PiTTV-SYR1：5’- GCTGTGCTCTCTACCCATCCAGTC -3’，

目的片段大小为132 bp。

用于检测鸽TTV EvaGreen实时荧光定量PCR方法的试剂盒，包括以上所述的引物。

实时荧光定量PCR反应体系（20 μL）为：Eva Green Mix混合液10.0 μL、上/下游引物（PiTTV-SYF1和PiTTV-SYR1）（10 μmol/L）各0.2 μL、模板2 μL、用灭菌双蒸水补足至20 μL。最佳反应条件为：95℃ 1 min预变性；95℃ 10 s、62℃ 20s，共40个循环。反应结束后，做出溶解曲线。

结果判断：

实时EvaGreen荧光定量PCR反应结束后，观察溶解曲线峰值（Tm值）分析试验结果：若在Tm=（86.02±0.18）℃出现单一的特异性峰判为鸽TTV阳性。

本发明提供检测鸽TTV EvaGreen实时荧光定量PCR检测引物及试剂盒，具有以下优点和效果：