[发明专利]靶向并引导Cas9蛋白高效切割TCR及B2M基因座的sgRNA

说明书

本发明提供靶向并引导Cas9蛋白高效切割TCR及B2M基因座的sgRNA。具体地，本发明提供一种用于制备通用型CAR‑T细胞的试剂，靶向TCR和/或B2M的sgRNA或用于表达所述sgRNA的表达载体。本发明的sgRNA能够高效、特异、稳定、不易脱靶、不相互干扰地敲除TCR和B2M基因，从而大幅度提高了基因敲除效率。此外，本发明还提供了用所述sgRNA改造的通用型CAR‑T细胞。本发明能有效降低移植物抗宿主病以及免疫排斥风险。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，明涉及一种具有核酸酶导向功能的核苷酸序列。

背景技术

嵌合抗原受体T细胞技术(Chimeric Antigen Receptor T-Cell,CAR-T)是目前较为有效的恶性肿瘤的治疗方式之一。该技术的基本原理是从患者体内抽取出T细胞并在体外培养。在培养过程中，利用基因工程改造的方法，让患者自身T细胞表达特异的肿瘤抗原受体，在识别肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原后，T细胞能被高效激活并大量增殖，释放抗肿瘤活性分子，从而发挥强效的肿瘤杀伤效果。经过改造的T细胞在体外大量增殖后，CAR-T会被注射回患者体内，进而对表达特异性抗原的癌细胞进行攻击。CAR-T疗法目前已经在血液瘤的治疗方面获得巨大成功，是新型而强大的抗击肿瘤手段。CAR-T疗法的技术核心是嵌合抗原受体，即CAR分子，CAR分子一般由胞外的肿瘤识别区域、连接区、跨膜区以及胞内的T细胞激活结构域组成，充当抗原识别作用的是胞外识别区，往往由能够识别和结合特异性抗原的单链抗体可变区SCFv发展而来，而包内激活结构域主要由共刺激分子-CD3ζ分子共同组成CAR分子识别抗原不依赖于白细胞抗原HLA分子，因此在肿瘤相关抗原识别方面相比于内源性的TCR分子具有明显的优势。

T细胞受体介导的体细胞激活，即T细胞膜表面表达T细胞受体(T cell receptor,TCR)，负责识别由主要组织相容性复合体(MHC，人中称为白细胞抗原，即HLA分子)所呈递的抗原，与B细胞受体不同，TCR不能识别游离的抗原，而是识别经MHC分子提呈的抗原肽片段。通常情况下，T细胞受体是异源二聚体，由两个不同的亚基所构成。T细胞受体与MHC所呈递的多肽的特异性结合会引发一系列生化反应，并通过众多的辅助受体、酶和转录因子激活T细胞，促进其分裂与分化。在同种异体移植过程中，移植物中的淋巴细胞识别了受体细胞的抗原，发生免疫应答，攻击受体细胞，产生移植物抗宿主病(graft versus host Disease，GVHD)。

人白细胞抗原(human leucocyte antigen，HLA)，生物体对异种移植物或同种异体移植物常发生排斥作用，源于供体的基因编码受体所没有的抗原，被受体的免疫细胞识别后引起排斥反应，这一类抗原主要是人白细胞抗原即HLA抗原。同种异体移植(allotransplantation)，是指将来源于某一个体的器官、组织或细胞移植于另一个同种但不是同一个体上，使之形式相应替代功能的一直方式。同种异体移植往往面临着移植排斥以及移植物抗宿主病(GvHD)的风险。在本技术中，涉及将健康个体来源的CAR-T细胞移植至癌症患者体内，发挥抗肿瘤作用，属于同种异体移植范畴。

CRISPR/Cas9基因编辑技术，CRISPR(Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats)，全称为规律成簇间隔短回文重复，是近年来发展迅速的基因编辑工具，起初被发现是细菌用以保护自身对抗病毒感染的获得性免疫系统应答现象，是一种对付攻击者的基因武器。后来，研究人员发现，它可以经过改造和发展成为精确而高效的基因编辑工具，可以介导基因组序列的删除、插入、突变，甚至还可以激活或抑制目标基因，是一种可以广泛使用的基因编辑工具。