[发明专利]一种鉴别太平洋鳕鱼皮胶原蛋白的方法

说明书

本发明涉及一种使用专属性肽段组鉴别太平洋鳕鱼(Gadus macrocephalus)鱼皮胶原蛋白的方法，以及一组用于通过液相色谱‑串联质谱检测分析方法鉴定太平洋鳕鱼皮胶原蛋白的对照多肽，包含有序列为SEQ ID NO.1‑7的多肽。所述肽段组中虽有肽段在其他物种中存在，但其他物种中不会同时存在上述7条肽段，上述肽段组为太平洋鳕鱼皮胶原蛋白专有肽段组。

技术领域

本发明属于蛋白分析技术领域，具体涉及一种鉴别太平洋鳕鱼皮胶原蛋白的方法。

背景技术

胶原蛋白是多细胞生物中含量最丰富、分布最广泛的蛋白质种类之一。胶原蛋白独特的分子结构、氨基酸组成以及良好的生物相容性和促细胞增殖能力使其在功能食品、化妆品、生物材料以及医学组织工程等领域中得以广泛应用。太平洋鳕鱼(Gadusmacrocephalus)属于冷水性底层鱼类,为北方沿海出产的海洋经济鱼类之一,其皮肤胶原蛋白含有多种活性肽段，如促钙吸收活性、抗光老化活性以及提高免疫活性等。因此，其开发应用前景十分广阔。

不同来源的鱼皮胶原蛋白相比较，有的热稳定性好、机械强度高，有的生物相容性好，抗原性低，有的含有多种活性肽段，如抗光老化活性，增加骨密度活性，降血压活性等，使得应用方向各有差异。因此对相关产品的区分和鉴别就显得十分重要。

目前由于采用传统的电泳、氨基酸分析、红外光谱以及X-射线衍射等分析方法都无法区别不同来源的胶原蛋白，对相关产品的快速检测缺乏技术水平的支持，导致不少不良商人以次充好，欺骗消费者，因此需要一种高效准确的鉴定不同来源胶原蛋白的方法。

发明内容

本发明对太平洋鳕鱼(Gadus macrocephalus)鱼皮胶原蛋白进行了研究，建立了从多肽水平对太平洋鳕鱼皮胶原蛋白来源进行鉴别的技术，从而有效的弥补现有技术的不足。

本发明首先提供用于检测太平洋鳕鱼皮胶原蛋白的多肽组合，包含有如下序列的多肽：

SEQ ID NO.1:EGPSGAAGQDGR、

SEQ ID NO.2:GESGPAGPSGFAGPPGADGQTGPR、

SEQ ID NO.3:GAMGPAGPDGQQGSR、

SEQ ID NO.4:VGSPGPYGVGPSGIEGR、

SEQ ID NO.5:GESGDTGPK、

SEQ ID NO.6:GKPGLPGMPGSDGPPGHPGK、

SEQ ID NO.7:GPQGPAGPAGPK；

上述的肽段组用于检测太平洋鳕鱼皮胶原蛋白。

本发明还提供一种鉴别于太平洋鳕鱼皮胶原蛋白的方法，包括如下步骤：

1)取冻干胶原蛋白用0.3～0.5mol/L的醋酸溶解，浓度为2～4mg/mL；

2)将胶原蛋白溶液用0.1mol/L NH₄HCO₃溶液调节pH值为7.0～7.8，在40～50℃条件下处理1.5～2.5h，然后12000×g离心15～25min；

3)取400～1000μL离心后的上清液，加入1mg/mL的胰蛋白酶溶液(酶：底物＝1:25～50，w/w)，于37℃下酶解18～24h；

4)酶解液采用0.22μm的微孔滤膜过滤，用Zip 微量层析柱脱盐浓缩，待进行液相色谱-串联质谱联用分析；

5)液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)检测分析，分析条件如下：

流动相A：0.1％甲酸-乙腈，流动相B：0.1％甲酸-水；