[发明专利]一株产腈水合酶的菌株及用于生产对羟基苯乙酰胺的方法

说明书

本发明涉及一株产腈水合酶的菌株及用于生产对羟基苯乙酰胺的方法，属于生物技术领域，所述菌株分类命名为阿氏芽孢杆菌Jn‑102，已于2017年9月26日保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏编号：CGMCC No.14668。本发明提供的产腈水合酶的阿氏芽孢杆菌Jn‑102遗传稳定性好，培养成本低，产生的腈水合酶酶活力高，适用底物谱较宽，可直接利用该菌株直接转化对羟基苯乙腈合成对羟基苯乙酰胺，催化合成时无需加入表面活性剂、有机溶剂等透膜剂，避免引入外源杂质，有利于提取分离操作，工业应用具有优势。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一株生产腈水合酶的菌株，以及利用该菌株生产的腈水合酶催化制备对羟基苯乙酰胺的方法。

背景技术

腈是一类重要的化合物，它广泛存在于自然界的植物中，它的水解反应被广泛应用于氨基酸、酰胺、羧酸及其衍生物的合成，在有机合成中占有极其重要的地位。腈水解的方法主要有化学水解法和生物转化法。腈的化学水解因其需要强酸或强碱、高温、高压等反应条件，而且副产物多、产量低、环境污染严重，而大大地限制了它在工业上的应用。相反，生物转化法具有条件温和、环境污染小，并能实现化学选择性、区域选择性和对映选择性等优点。生物转化法涉及的酶系主要有腈水合酶、酰胺酶和腈水解酶。腈水合酶(Nitrilehydratase)是由α-亚基和β-亚基构成的多亚基金属酶，可以催化腈类物质转化成相应的酰胺类物质，在有机合成工业具有较大的应用潜力。

腈水合酶广泛存在于微生物群体内，在红球菌(Rhodococcus)、假单胞菌(Pseudomonas)、假诺卡氏菌(Pseudonocardia)、节杆菌(Arthrobacter)、芽孢杆菌(Bacillus)、棒杆菌(Corynebacterium)及短杆菌(Brevibacterium)等微生物中均有发现，研究较为广泛。N itto公司先后分别用产NHase的微生物菌株Rhodococcus sp.N-771、Pseudomonas chlororaphis B23、Rhodococcusrhodochrous J 1来生产丙烯酰胺，其产量不断提高。但在生产过程中，微生物NHase受到底物和产物的抑制作用，其半衰期较短。赵爱民等已筛选到一株产NHase活性较高的马红球菌Rhodococcus equi SHB2121，并研究了该菌形成NHase的最适条件、纯化及性质，酶活比初筛时提高95倍。马士忠等筛选出一株产NHase的诺卡氏菌KY1023，并发现该酶具有广谱性，不仅能高效地催化丙烯腈水解，而且能催化乙腈水解，分别生成对应的酰胺，转化率都达到98％以上。目前，微生物NHase在工业上仅限于丙烯酰胺和烟酰胺的生产，但极大地促进了NHase的应用研究。由于NHase可以以非天然化合物为底物，因此可通过NHase生物转化获得非天然产物。对羟基苯乙酰胺是合成β-肾上腺素受体阻滞药阿替洛尔的关键中间体，具有好的市场应用前景，目前国内外主要采用化学法合成，存在步骤复杂、污染严重等问题，生物酶法是不错的替代方案。蔡谦等以对羟基苯乙腈为底物筛选到1株红色红球菌，具有转化生产对羟基苯乙酰胺的能力，但酶活不高，且存在严重的底物抑制现象。通过筛选具有新特性的微生物NHase或采用蛋白质工程技术改造现有微生物NHase的特性等方法可解决以上问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供从土壤中分离得到的一株高效生产腈水合酶的菌株，并应用该菌株产生的腈水合酶酶法制备对羟基苯乙酰胺的方法。本发明所提供的产腈水合酶的菌株是从济宁地区农田土壤中分离得到，这是一株腈水合酶分泌能力极高的菌株，培养方法简单，生长速度快，不易变异，可以直接用于酶法制备对羟基苯乙酰胺。

本发明的技术方案如下：

一株产腈水合酶的菌株，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期为2017年9月26日，分类命名为阿氏芽孢杆菌Jn-102(Bacillus aryabhattai)，保藏编号为：CGMCC No.14668。

进一步，该菌株的16S rRNA基因序列如SEQ.NO.1。