[发明专利]可水解对苯二甲腈制备对氰基苯甲酸的腈水解酶

说明书

本发明公开了来源于泛菌属(Pantoea sp.AS‑PWVM4)的腈水解酶N1及其基因、拟南芥(Arabidopsis thaliand)的腈水解酶N2及其基因、敏捷食酸菌(Acidovorax facilis 72W)的腈水解酶N3及其基因、瘦鞘丝藻属(Leptolyngbya sp.)的腈水解酶N4及其基因、甘蓝油菜马齿苋(Brassica oleracea var.oleracea)的腈水解酶N5及其基因和荠蓝(Camelina sativa)的腈水解酶N6及其基因，并利用该腈水解酶作为生物催化剂制备对氨甲基苯甲酸中间体对氰基苯甲酸。以相应腈水解酶的静息细胞可催化100g/L的底物，转化率大于99％，本方法具有反应条件温和、无污染和工艺路线简单等显著特点，有较大的工业应用前景。

技术领域

本发明涉及基因及其蛋白产物，具体涉及来源于泛菌属(Pantoea sp.AS-PWVM4)的腈水解酶N1及其基因、拟南芥(Arabidopsis thaliand)的腈水解酶N2及其基因、敏捷食酸菌(Acidovorax facilis 72W)的腈水解酶N3及其基因、瘦鞘丝藻属(Leptolyngbya sp.)的腈水解酶N4及其基因、甘蓝油菜马齿苋(Brassica oleracea var.oleracea)的腈水解酶N5及其基因和荠蓝(Camelina sativa)的腈水解酶N6及其基因，并利用其生物催化制备对氰基苯甲酸，属于应用微生物与酶工程领域。

背景技术

对氨甲基苯甲酸为一种止血剂，适用于肺、肝、胰、前列腺、甲状腺、肾上腺等手术时的异常出血，妇产科和产后出血及肺结核咯血、痰中带血、血尿，前列腺肥大出血、上消化道出血等。工业上主要采用对氰基苯甲酸催化氢化法制备对氨甲基苯甲酸。

文献报道的对氰基苯甲酸的生产方法主要有三种：以对氨基苯甲酸为原料的Sandmeyer法、以对甲酰基苯甲酸为原料的氨氧化法与钯催化氰基化法(华西药学杂志，2015，30(5)，528～530)，但是，这些方法普遍存在反应条件苛刻、氰化试剂存在剧毒、环境污染大、价格昂贵等问题。

生物催化法相对于化学法具有反应条件温和、环境友好、无重金属污染等优势。1994年，Turner等报道了使用固定化的红球菌(Rhodococcus sp.)催化对苯二甲腈选择性水解制备对氰基苯甲酸的方法，但是底物浓度只有25mmol/L，产物的收率为62％(J.Chem.Soc.Perkin Trans.1 1994,1679～1687)；Meth-Cohn等利用红球菌AJ270(Rhodococcus sp.AJ270)可以实现60mmol/L底物的转化，收率为81％(J.Chem.Soc.PerkinTrans.1 1997,3197～3204)。

但是，目前已报道的生物催化合成对氰基苯甲酸的方法中，普遍存在底物浓度低、反应时间长、酶催化效率低等问题。

发明内容

针对已报道制备方法中底物浓度低、反应时间长、酶催化效率低等问题，本发明采用基因挖矿的手段，得到的腈水解酶能高效催化对苯二甲腈选择性水解制备对氰基苯甲酸。该过程具有反应条件温和、反应速度快、无污染和工艺路线简单等显著特点。其化学反应式如下：

本发明所述的腈水解酶N1的基因编码333个氨基酸残基，其序列为SEQ ID No.1；N2的基因编码339个氨基酸残基，其序列为SEQ ID No.2；N3的基因编码369个氨基酸残基，其序列为SEQ ID No.3；N4的基因编码334个氨基酸残基，其序列为SEQ ID No.4；N5的基因编码343个氨基酸残基，其序列为SEQ ID No.5；N6的基因编码346个氨基酸残基，其序列为SEQ ID No.6。

本发明的具体步骤如下：