[发明专利]一种菌株胞外产物的发酵生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物制药技术领域，尤其涉及一种菌株胞外产物的发酵生产方法。

背景技术

埃博霉素B(Epothilone)是由粘细菌纤维堆囊菌产生的大环内脂类次级代谢产物，是一种新型的抗肿瘤药物，其分子式C27H41NO6S，分子量为507.68，分子结构式如下式(1)所示：

1995年Bollag等人发现埃博霉素B有和紫杉醇类似的作用机制，通过促微管聚合作用从而抑制肿瘤细胞的增殖，并且与耐紫杉醇相比，埃博霉素B毒性更小，水溶性更好，对耐药性细胞的作用更强，抗肿瘤谱更广等优点，同时化学结构简单，易于进行化学合成和修饰等。这些特征使得埃博霉素被誉为最具有潜力的抗肿瘤新药之一，引起了全世界的化学家，生物学家以及药学家的极大兴趣和研究热情。

在现有技术中，埃博霉素B等胞外产物通常采用发酵法进行制备。但是，目前在发酵制备埃博霉素B的产量非常低，其主要原因在于埃博霉素对生产菌株的毒性和反馈抑制作用较大，从而导致埃博霉素B的产量难以得到显著提高。此外，采用传统的发酵法进行埃博霉素B的发酵生成过程中会产生大量的同系物，从而最终得到的产物中埃博霉素B的纯度非常底。

庆大霉素(Gentamicin，CM)是由放线菌属小单孢子菌(Micromonospora purprua)发酵产生的氨基糖苷类光谱抗生素，1963年被美国人Weinstein首次发现，1969年被用于临床。庆大霉素的作用机理为：抑制细菌蛋白质的合成。GM能影响蛋白胨的合成的许多环节：(1)起始阶段，抑制70S启动复合物的形成；(2)选择性地与30S亚基上靶蛋白结合(P10)，使mRNA上的密码错译，导致异常的、无功能的蛋白合成；(3)阻碍终止因子(R)与核蛋白体A位结合，使已合成的肽链不能释放并组织70S核蛋白体的解离，最终造成菌体内核蛋白体的耗竭。此外，氨基糖苷类通过离子吸附作用附着于细菌体表面造成细胞膜缺损致细胞膜通透性增加，细胞内钾离子、腺嘌呤核苷酸、酶等重要物质外漏，从而导致细菌死亡，对静止期细菌作用最强。

有鉴于此，有必要对现有技术中的埃博霉素B或者庆大霉素B等菌株胞外产物的发酵法进行生产的方法予以改进，以解决上述问题。

发明内容

本发明的目的在于公开一种菌株胞外产物的发酵生产方法，用以实现采用发酵法制备菌株胞外产物的产量，并抑制发酵过程中的产物对菌体的反馈抑制。

为实现上述目的，本发明提供了一种菌株胞外产物的发酵生产方法，包括以下步骤：

步骤(1)：将斜面菌种接种于种子培养基上，并在种子罐上进行培养，温度为28～35℃，通气量为1:0.5～1:1.5vvm，罐压0.03～0.07MPa，转速为200～300rpm，培养时间72～96h；

步骤(2)：将种子培养基转接于发酵培养基进行培养，温度为26～35℃，风量为1:0.5～1:1.5vvm，罐压0.03～0.07MPa，转速为200～300rpm，培养时间168～240h；

步骤(3)：在发酵进行至48～72h，启动分离装置，含有菌株的发酵培养基透过小分子膜进入分离装置，分离装置中的第一型树脂对菌株胞外产物进行吸附；

步骤(4)：在发酵进行至48～72h，启动补料装置，流加补料培养基；

步骤(5)：当发酵结束后，向发酵罐中投加第二型树脂对菌株胞外产物进行吸附，合并第一型树脂和第二型树脂，使用乙酸乙酯进行解析。

作为本发明的进一步改进，所述步骤(1)中所述种子培养基的组成为：马铃薯淀粉0.8～2.0g/L，葡萄糖0.1～0.5g/L，酵母抽提物0.1～0.5g/L，黄豆饼粉0～1.6g/L，硫酸镁0.05～0.2g/L，大豆蛋白胨0.2～0.8g/L，玉米粉0～1.2g/L，硝酸钾0～0.06g/L，氯化钙0.05～0.2g/L，蛋白胨0～0.3g/L，CaCO₃ 0～0.5g/L，余量为水，种子培养基的pH为7.0～8.0。