[发明专利]一种人体精子顶体酶药盒

说明书

本发明属于精子顶体酶测量技术领域，公开了一种人体精子顶体酶药盒，将明胶混合液制成溶胶状基质液，涂制固定成均匀底膜，显示顶体酶(Acroin)的活性；将精子在超薄明胶底膜上孵育，离心及磷酸盐缓冲液清洗去除膜抑制因子精子顶体解聚，释放并溶解‑明胶基质膜，形成围绕在精子前部周围的孔区；通过光镜观察，光线穿透孔区，在精子头周围看到明亮的晕环，在染色后深紫蓝色背景的衬托下，观察到酶反应，测量每个亮环直径的大小来估计单个精子顶体酶活性的强弱。本发明方法简单且成本低，准确计算顶体酶的阳性反应率，为试管婴儿技术筛选出活性更强的精子，提高成功率。

技术领域

本发明属于精子顶体酶测量技术领域，尤其涉及一种人体精子顶体酶药盒。

背景技术

人精子顶体内含有人类已知的24种酶，其中以透明质酸酶(hyaluronidase)，(Acrosin)及顶体蛋白酶(Acrosin)与受精关系最为密切。顶体酶(Acrosin)在受精时精子与卵子结合过程中起着重要作用。测定精子顶体酶(Acrosin)活性是评价精子功能的指标之一。在以往对精子顶体内酶的研究方法中，多数是以生化法检测整份标本全部精子的酶活性强弱、阳性率以及酶反应的时间。例如对精子顶体精氨酸酰胺酶活性的测定需用聚乙二醇辛基苯基醚(Triton液)、苯甲酰精氨酰对硝基苯胺(BAPNA液)等昂贵试剂且只能反应整份标本顶体酶全部活性，对于单个精子顶体内的顶体蛋白酶(Acrosin)等却不能做更精确的分析。由于精子本身比较小，一般显示酶活性的方法在普通光镜下较难观察到。

综上所述，现有技术存在的问题是：目前检测精子顶体酶方法存在操作复杂，成本较高。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种人体精子顶体酶药盒。

本发明是这样实现的，一种人体精子顶体酶药盒，所述人体精子顶体酶药盒将明胶基质液制成溶胶状基质液，涂制固定成均匀底膜，显示顶体酶(Acrosin)的活性；将精子在超薄明胶底膜上孵育，离心及磷酸盐缓冲液清洗去除膜抑制因子精子顶体解聚，释放并溶解明胶基质膜，形成围绕在精子前部周围的孔区；通过光镜观察，光线穿透孔区，在精子头周围看到明亮的晕环，在染色后深紫蓝色背景的衬托下，观察到酶反应，测量每个亮环直径的大小来估计单个精子顶体酶(Acrosin)活性的强弱。

进一步，所述人体精子顶体酶药盒的制作方法包括以下步骤：

步骤一，底物膜的制作与固定；

步骤二，采集精液标本液化后，入5ml离心管以相对离心力864×g离心10min，弃精浆，往沉淀物中加入pH为7.3的磷酸盐缓冲液2ml，摇匀；再次以相对离心力864×g离心l0min，弃上清液，而后将沉淀物悬浮于2倍以上PBS中；

步骤三，以吸管吸取精子悬浮液50ul滴于已纠正pH值的底物膜片上，并以吸管管身将其滚涂均匀，置37℃温箱中孵育；每例标本涂制4份，分别于30min及1、2、3h后取出；室温下干燥后，用0.02％的台盼蓝或者结晶紫染色30s后平放于滤纸上，室温下干燥以待观察；同时也对部分底膜片在孵育前先经染色并干燥，而后涂片、孵育，涂片张数及取出时间同上述孵育后再染色的底膜片；

步骤四，以普通光镜观察，在不同放大倍数下，可见深紫蓝色底物背景，及紫黑色精子全貌；每例标本随机观察200个精子的顶体酶(Acrosin)阳性反应数来判断阳性率，以测微尺测量反应区晕环直径大小来判断顶体酶(Acrosin)的活性强度。

进一步，所述步骤一具体包括：

(1)称取0.48g干明胶置人三角瓶，加双蒸水4ml，将三角瓶放入水浴锅，37℃条件下溶化成均质液；称取0.48g干明胶(Gelatin)置入三角瓶，加双蒸水4ml，将三角瓶放入水浴锅，摇匀，使其溶解成透明液；将所制12％明胶溶液；