[发明专利]一种牙鲆弹状病毒PCR检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种牙鲆弹状病毒PCR检测引物及包括该检测引物的检测方法与试剂盒，属于分子生物学技术领域。

背景技术

牙鲆弹状病毒 (Hirame rhabdovirus, HIRRV) 于1984年首次在日本兵库县濒死的养殖牙鲆和香鱼中分离得到。随后又分别于1997在韩国南部海域的养殖牙鲆，2008年在中国山东养殖的石鲽鱼，2013年在波兰养殖的淡水鱼河鳟中分离得到HIRRV的韩国株 (CA-9703)、中国株 (SR080113) 和欧洲株 (j.No.207237)。HIRRV分别于2013年在韩国西部海域，2015年在韩国南部海域引起养殖的中国花鲈和黑鲷大规模死亡。流行区域已经由东南亚逐渐扩大到欧洲，易感宿主也由海水鱼过渡到淡水鱼，流行区域和易感种群均有逐年扩大的趋势，严重阻碍了全球水产养殖业特别是海水养殖业的健康发展，造成了巨大的经济损失。人工感染试验结果表明，牙鲆14天累积死亡率为97.8%，花鲈7天累积死亡率高达100%。而且2005年签订的《中韩进出口活水生动物检验检疫协议》中明确规定需要对进出口的鲈鱼、真鲷、牙鲆、大菱鲆、鲤鱼和鲫鱼等要进行HIRRV的检测。

虽然已经有HIRRV DNA疫苗和亚单位疫苗具有免疫保护效果的报道，但迄今为止并没有商品化的相关疫苗投放市场。因此目前控制HIRRV的唯一方法仍旧是及早发现并采取措施。因此建立HIRRV的快速检测方法是非常必要的，目前针对HIRRV的检测方法主要有细胞生物学、组织病理学和分子生物学等。综合比较以上三种技术PCR检测技术具有特异型好，操作简便，检测成本低廉等特点，适用于规模化养殖场HIRRV病毒的快速检测与研究。核蛋白 (N) 是HIRRV中含量最高的蛋白，具有保守性高、免疫原性强等特点，同时也与HIRRV的转录、翻译、复制、抑制宿主细胞基因转录和凋亡有关。本文综合以上几点考虑，选取N蛋白保守序列为目的基因设计特异性引物，建立能特异性检测HIRRV的PCR检测技术，以期为口岸安全和水产养殖业中HIRRV病的防治提供帮助。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种牙鲆弹状病毒PCR检测引物，能够快速、准确地检测鱼类是否患有牙鲆弹状病毒病。

本发明的第二个目的是提供利用上述引物来检测鉴定牙鲆弹状病毒的方法。

本发明的第三个目的是提供一种检测鉴定牙鲆弹状病毒的试剂盒。

本发明的上述目的可通过采取如下技术方案达到：1、选取含量最为丰富的核蛋白基因为检测目的基因。2、比对不同亚型的HIRRV基因组，选取核蛋白基因保守序列为检测目的基因。

上下游引物的核苷酸序列为：

HIRRV-N-639-F：5’- ATGAGGCTGAGCGGAACC -3’ (SEQ ID NO.1)

HIRRV-N-1020-R：5’- CTTTTTGACCAGAAGGCGAG -3’ (SEQ ID NO.2)

作为优选，应用PCR检测引物组进行扩增的条件为：

采用20μL的反应体系，包括：PCR-Mix 10μL；ddH2O 7μL；浓度10pmol/μL的上、下游引物各1μL；cDNA 1μL；

设置如下条件进行反应：预变性95℃，4min；再经95℃变性45s，57℃退火35s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸10min。

阳性对照：HIRRV病毒阳性对照质粒通过以下制备方法获得：以HIRRV病毒cDNA为模板，以HIRRV-N引物进行PCR扩增，得到381bp的扩增产物，将扩增产物回收并纯化后克隆至pMD-19T载体，即得pMD-19T-N阳性质粒。

阴性对照：pMD-19T空质粒。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

1、本发明HIRRV病毒PCR检测引物，能够快速、准确地检测鱼类是否患有HIRRV病毒病；

2、本发明的试剂盒灵敏度高，特异性好，成本低，能够简便快速地对规模化养殖场进行HIRRV病毒检测，大大降低了检测HIRRV的时间及成本。

附图说明

图1为RT-PCR产物电泳图，图中M：Marker；Lane 1：阳性质粒；Lane 2-3：感染HIRRV的EPC细胞悬液。

Lane 4: pMD-19T空质粒；Lane 5-6：正常的EPC细胞悬液。；