[发明专利]用于快速鉴定猪的红黑毛色基因的核酸、试剂盒及方法

权利要求书

1.一种用于KASP基因分型快速鉴定猪的红黑毛色基因的核酸，其特征在于，该核酸包括红毛特异性引物、黑毛特异性引物和下游通用引物，其中，所述红毛特异性引物的序列如SEQ ID No.1所示，所述黑毛特异性引物的序列如SEQ ID No.2所示，所述下游通用引物的序列如SEQ ID No.3所示，红毛特异性引物的5'端标记一个FAM荧光基团，黑毛特异性引物的5'端标记一个HEX荧光基团，两特异性引物的3'端均带淬灭基团。

2.含有如权利要求1所述核酸的试剂盒。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于KASP基因分型检测所用试剂。

4.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述红毛特异性引物对应检测FAM，所述黑毛特异性引物对应检测HEX。

5.一种用于KASP基因分型快速鉴定红黑毛色基因方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)从猪组织中提取DNA作为待测样品；

(2)对提取的所述DNA，采用KASP基因分型试剂和如权利要求1所述用于快速鉴定猪的红黑毛色基因的核酸进行荧光定量PCR扩增；同时设置含有如SEQ ID No.4所示序列作为红毛基因阳性对照，含有如SEQ ID No.5所示序列作为黑毛基因阳性对照，含有如SEQ IDNo.4和SEQ ID No.5所示序列作为杂合子阳性对照；

(3)利用荧光定量PCR仪上的位点分析功能分析读数；

(4)结果判定：根据两种荧光基团的荧光值在坐标上的位置进行判定，当荧光值偏向代表红毛基因的荧光基团值的X轴，并与已知红毛基因阳性对照聚在一起，则所述待测样品的个体基因型为红毛TT基因型；当荧光值偏向代表黑毛基因的荧光基团值的Y轴，并与已知黑毛基因阳性对照聚在一起，则所述待测样品的个体基因型为黑毛CC基因型；当荧光值分布偏向于坐标45度方向，并与杂合子基因型对照个体聚在一起，则该个体基因型为TC基因型。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述荧光定量PCR扩增的反应体系中，所述红毛特异性引物、黑毛特异性引物及下游通用引物的引物终浓度为0.2-0.5pmol/μl，所述荧光定量PCR扩增的反应程序为：94℃15min；94℃20s，61-55℃60s，10个循环，其中每个循环降低0.6s；94℃20s，55℃60s，26个循环。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，如果所述步骤(3)的结果不理想，则继续进行如下循环：94℃20s，57℃60s，3个循环，重新分析；

该步骤重复几次直到不同基因型分别聚得明显看出结果为止。

8.如权利要求5-7中任一项所述的方法，其特征在于，还包括验证步骤，所述验证步骤采用方法为：用如SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示的引物对对待测样品的DNA进行PCR扩增，将扩增的阳性产物进行测序，测序结果与如SEQ ID No.8所示红毛基因型序列及如SEQID No.9所示黑毛基因型序列进行比对，从而获得待测样品的基因型。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增程序为：预变性94℃5分钟；随后进入循环：变性94℃30秒，退火60℃30秒，延伸72℃40秒，循环35次；终延伸72℃7分钟后结束反应。