[发明专利]血浆游离DNA甲基化检测文库的构建方法、试剂盒及应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种血浆游离DNA甲基化检测文库的构建方法、试剂盒及应用。

背景技术

血浆游离循环肿瘤DNA(Circulating tumor DNA，ctDNA)是指由坏死或凋亡的肿瘤细胞释放到血浆中的单链或者双链DNA，约占游离DNA的0.1％-1％。ctDNA片段大小通常为160-180bp，在血液中半衰期2小时，携带有SNP(点突变)、InDel(插入缺失)、CNV(拷贝数)、fusion(融合基因)、甲基化等信息。ctDNA在血液循环系统中不断流动，可实时反映肿瘤患者当前信息。

与传统检测方法比较，ctDNA检测有诸多优势：1)取样方便：ctDNA检测只需抽血即可完成对肿瘤细胞DNA的解析，避免穿刺、手术等组织活检的风险。2)检测技术成熟：利用二代测序技术(NGS)检测ctDNA，灵敏准确、假阳性率低，可检测到低至0.1％的低频突变。3)检测全面：几乎所有肿瘤细胞都可释放DNA到血液中，ctDNA能体现患者体内肿瘤的综合情况。

基于上述理由，ctDNA有望成为临床检测、诊断和疗效监视的新兴生物标志物，蕴含巨大的临床应用价值。

DNA甲基化是指在DNA甲基化酶的作用下在胞嘧啶的5C位置上添加一个甲基基团，形成5-甲基胞嘧啶。体内DNA甲基化异常可以导致疾病甚至癌症的发生。DNA甲基化检测具有很强的稳定性和组织特异性，近来研究表明可通过DNA甲基化实现前列腺癌的无创检测(Yao L,Ren S,Zhang M,et al.Identification of specific DNA methylation sites on the Y-chromosome as biomarker in prostate cancer[J].Oncotarget,2015,6(38):40611.)。

ctDNA甲基化检测将兼备ctDNA检测和DNA甲基化检测的优势，对肿瘤的诊断将具有更高的灵敏度、特异性和诊出率。

ctDNA甲基化检测主要分为两类：特定位点的检测和全基因组甲基化检测。针对特定位点的检测技术主要基于PCR，如：常规PCR、甲基化特异性PCR、qRT-MSP等。对于全基因组甲基化检测，由于ctDNA甲基化位点浓度太低，常规的BS-Seq、RRBS、MBD-Seq和MeDIP-Seq都不适用。随着高通量测序技术的发展，人们逐渐开发了鸟枪法大规模平行测序、全基因组甲基化CpG级联放大后测序(MCTA-Seq)技术，用于研究ctDNA的全基因组甲基化水平。

cfDNA含量低(十几纳克)，因此常规微量甲基化建库方法(起始量为30-100ng)不适用。在现有技术基础上，发明人优化实验参数，探索适用于cfDNA的甲基化微量建库技术，旨在发明一项基于二代测序、切实可行的甲基化建库方法，用于改变本研究领域cfDNA甲基化测序方面的困境。

发明内容

本发明旨在提供一种血浆游离DNA甲基化检测文库的构建方法、试剂盒及应用，以解决现有技术中血浆游离DNA不能采用常规微量甲基化建库方法构建文库的技术问题。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种血浆游离DNA甲基化检测文库的构建方法。该构建方法包括以下步骤：S1，从血液样本中提取血浆游离DNA；S2，对血浆游离DNA进行末端修复及3’端添加A碱基；S3，将S2得到的血浆游离DNA的末端连接C甲基化修饰的接头；S4，对S3得到的产物进行重亚硫酸盐转化，并进行PCR扩展；S5，对S4的PCR产物进行磁珠纯化，去除掉未非特异性扩增的小片段DNA及引物二聚体；以及S6，对S5的产物进行PCR扩增，并进行磁珠纯化，得到血浆游离DNA甲基化检测文库。

进一步地，C甲基化修饰的接头为如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的脱氧核苷酸序列。

进一步地，血液样本为前列腺癌患者血液样本。

进一步地，构建方法还包括对构建得到的文库进行质量检测的步骤。