[发明专利]一种基于总DNA测序结果的细胞器基因组筛选方法

说明书

技术领域

本发明属于生物信息领域，具体地，本发明涉及一种基于总DNA测序结果的细胞器基因组筛选方法及应用。

背景技术

随着一代测序技术(Roche公司)、二代测序技术(Illumina公司)和三代测序技术(PacBio公司)的诞生，测序通量的提升和测序成本的降低极大的推动了基因组学的发展，在此背景下，越来越多的植物和动物的基因组逐渐被科学家破译，揭秘基因组的特征成为亟待解决的难题。

植物的基因组分为细胞核基因组和细胞器基因组，细胞器基因组包括叶绿体和线粒体基因组，它们表现出非孟德尔遗传特性，一般为母性遗传。细胞器基因组通常是环状DNA分子，编码部分但不是全部的细胞器蛋白质。叶绿体是植物进行光合作用的主要场所，而线粒体基因组是植物进行能量代谢的工厂，已有研究结果表明(TIAN X,ZHENG J,HU S The Rice Mitochondrial Genomes and Their Variations[J].Plant Physiology,2006,140(2):401-10.)，从总DNA中获得细胞器基因组序列切实可行。

综合已有的研究，目前对细胞器基因组的研究主要通过实验技术提取细胞器DNA，然后测序获得完整细胞器基因组，相比较动物细胞器基因组的提取，现阶段还未有高效的植物细胞器DNA提取方法，有研究报道，植物叶绿体的提取中或多或少的带有核DNA的污染(参考SHI C,HU N,HUANG H,GAO J,ZHAO YJ An improved chloroplast DNA extraction procedure for whole plastid genome sequencing[J].PLoS ONE,2012,7:e31468.)。随着测序技术的发展，核基因组的研究已成为热点，由于植物细胞器DNA提取方法的限制，细胞器基因组的研究明显滞后于核基因的研究。而通过总DNA提取细胞器基因组，通过从头组装和参考组装相结合的方法还未被开发，因此迫切需要开发相应的筛选和组装方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于总DNA测序结果的细胞器基因组筛选方法及应用。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

一种基于总DNA测序结果的细胞器基因组筛选方法，该方法是通过设计的算法对植物总DNA测序获得的核苷酸序列和已发表的细胞器叶绿体/线粒体基因组进行比较分析，筛选出其中的细胞器核苷酸序列，并用开源基因组拼接软件对筛选的结果进行De novo组装，获得细胞器基因组的框架图，然后通过实验的方法填补少量Gaps，最后获得完整的细胞器基因组。同时本发明通过PCR聚合酶链式反应技术实验验证了组装结果的可行性。

具体地，一种基于总DNA测序结果的细胞器基因组筛选方法，包括下述步骤：

(1)从NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)下载目前为止已发表的细胞器基因组序列(植物分为叶绿体和线粒体基因组，动物为线粒体基因组)。

(2)将总DNA测序的数据通过脚本转换为fasta序列，构建总DNA数据集，用formatdb软件对步骤(1)获得的数据构建比对库。

(3)利用blast序列比对软件，将步骤(1)和步骤(2)获得的结果进行两两比对。

(4)用本发明开发的算法对步骤(3)获得的结果进行数据筛选，筛选出可能的细胞器基因组序列。

(5)利用本发明开发的数据挖掘模块对步骤(4)的结果进行数据挖掘，筛选出可能与CMS相关的ORF。

(6)利用多个(≥2)开源基因组拼接软件进行基因组拼接，并将不同拼接软件获得结果进行互相验证。

(7)对步骤(6)获得的结果进行筛选，获得片段长度(Contigs/Scaffolds)≥100bp的核苷酸序列。

(8)选定一个参考细胞器基因组，通过blat软件将步骤(7)获得的片段比对到参考基因组。

(9)利用本发明开发的算法(伪代码)对步骤(8)获得的结果进行片段前后关系定位，片段之间没有重叠的区域(Gaps)用100个N进行填充，以待后续实验补洞，获得伪细胞器基因组。

所述的伪代码为：

Begin

输入：步骤(8)获得的结果文件contigBlatResult，步骤(6)获得的Contigs/Scaffolds文件assemblyFasta，结果文件；

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while contigBlatResult