[发明专利]应用于肝细胞癌的一组实时定量PCR相对定量的内参基因及其筛选方法

说明书

本发明涉及基因技术领域，特别涉及应用于肝细胞癌的一组实时定量PCR相对定量的内参基因及其筛选方法。本发明得出TFG和SFRS4可作为肝细胞癌细胞株研究中较稳定的内参基因。常用的内参基因的表达稳定性经过评估后发现ACTB可作为内参进行应用，而GAPDH、HPRT1和TUBB则不适合作为肝细胞癌研究相关的内参基因。

技术领域

本发明涉及基因技术领域，特别涉及应用于肝细胞癌的一组实时定量PCR相对定量的内参基因及其筛选方法。

背景技术

基因表达检测是分子生物学研究的重要手段，实时定量PCR(qRT-PCR)作为一种可以精确定量基因表达水平的研究策略，近年来得到广泛应用。qRT-PCR可分为绝对和相对定量，相对定量法由于具有灵敏度高、重复性好、易于操作和结果可靠等特点，应用更为广泛。基于2^-ΔΔCt的计算策略是目前用来获取两个转录本间表达水平差异最常见的相对定量方法。该方法需要以在表达体系中基本恒定不变的内参基因作为对照，且待研究基因与内参基因具有基本一致的扩增效率前提下进行检测和计算。我们首先通过在10种人肝细胞癌(HCC)细胞系的48张全基因组表达谱芯片数据中初筛到19个表达最稳定的候选内参基因，再加上4个目前公认的内参基因ACTB、GAPDH、HPRT1和TUBB，一起在9种HCC细胞系中进行其表达量稳定性的qRT-PCR评估。将测量到的C_t值用迭代排除法进行RefFinder整合分析，评估出TFG和SFRS4以其最佳的表达稳定性，可作为HCC细胞系qRT-PCR新的内参基因。常用的ACTB稳定性表现位居第三，可作为传统的备选内参，而GAPDH、HPRT1和TUBB则在表达稳定性上不能达到在HCC细胞系中作为内参基因使用的要求。

发明内容

本发明公开一种实时定量PCR相对定量的内参基因及其筛选方法，本发明得到TFG和SFRS4可作为肝细胞癌细胞株研究中较稳定的内参基因。

为解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：

一种实时定量PCR相对定量的内参基因，其特征在于：所述的内参基因为TFG和SFRS4中的一种，所述内参基因作用于肝细胞癌细胞系。

一种内参基因的筛选方法，包括如下步骤：

(1)全基因表达谱芯片数据收集以及候选内参基因初步筛选；

(2)选取细胞株进行传代培养，提取细胞株RNA并进行cDNA合成；

(3)定量PCR引物设计及引物扩增效率检验；

(4)定量PCR后对候选基因表达稳定性评估。

所述步骤(1)中采用以细胞种类为单元进行数据筛选，基因在10种肝癌细胞系中的表达量均以平行测量MAS 5.0信号值的算术平均为代表。筛选标准主要依据基因在10种肝癌细胞中表达量的变异系数CV0.11，且基因具有一定的表达水平以及控制任意两种细胞间表达量的极差不得过高MFC＝Max(I_i)/Min(I_i)1.4，其中I_i表示在每一个细胞样本中基因的表达。

所述步骤(2)选取细胞株为肝细胞癌细胞株：Huh-7、Hep3B、PLC/PRF/5、MHCC-97L、MHCC-97H、HCCLM3、SNU-398、SNU-449、SNU-475。除Huh-7来自HCV感染的肝癌病人外，其余细胞株均来自于HBV感染的肝癌病人。

所述Huh-7、Hep3B、PLC/PRF/5、MHCC-97L、MHCC-97H、HCCLM3在10％胎牛血清的DMEM培养基中进行传代和培养，所述SNU-398、SNU-449、SNU-475在10％胎牛血清的RPMI1640培养基中进行传代、培养，所述细胞均在5％二氧化碳培养箱中于37℃孵育培养。