[发明专利]应用于肝细胞癌的一组实时定量PCR相对定量的内参基因及其筛选方法

权利要求书

1.应用于肝细胞癌的一组实时定量PCR相对定量的内参基因，其特征在于：所述的内参基因为TFG和SFRS4，所述内参基因作用于肝细胞癌细胞系。

2.一种权利要求1所述的内参基因的筛选方法，包括如下步骤：

(1)全基因表达谱芯片数据收集以及候选内参基因初步筛选；

(2)选取细胞株进行传代培养，提取细胞株总RNA并进行cDNA合成；

(3)定量PCR引物设计及引物扩增效率检验；

(4)定量PCR后对候选基因表达稳定性评估；

所述步骤(1)中采用以细胞种类为单元进行数据筛选，基因在10种肝癌细胞系中的表达量均以平行测量MAS 5.0信号值的算术平均为代表；筛选标准主要依据基因在10种肝癌细胞中表达量的变异系数CV＜0.11，且基因具有一定的表达水平以及控制任意两种细胞间表达量的极差不得过高MFC＝Max(I_i)/Min(I_i)＜1.4，其中I_i表示在每一个细胞样本中基因的表达；

所述步骤(2)选取细胞株为肝细胞癌细胞株：Huh-7、Hep3B、PLC/PRF/5、MHCC-97L、MHCC-97H、HCCLM3、SNU-398、SNU-449、SNU-475；除Huh-7来自HCV感染的肝癌病人外，其余细胞株均来自于HBV感染的肝癌病人。

3.根据权利要求2所述的内参基因的筛选方法，其特征在于：所述Huh-7、Hep3B、PLC/PRF/5、MHCC-97L、MHCC-97H、HCCLM3在10％胎牛血清的DMEM培养基中进行传代和培养，所述SNU-398、SNU-449、SNU-475在10％胎牛血清的RPMI1640培养基中进行传代、培养，所述细胞均在5％二氧化碳培养箱中于37℃孵育培养。

4.根据权利要求2所述的内参基因的筛选方法，其特征在于：所述步骤(2)中提取细胞株总RNA并进行cDNA合成步骤包括每种细胞系收集约5×10⁶对数生长期细胞，加1毫升Trizol裂解，轻轻吹打均匀，室温静置5分钟，使其充分裂解；4℃12000g离心5分钟，弃沉淀；按照200微升氯仿/1毫升Trizol加入氯仿，剧烈震荡30秒后室温静置15分钟待其分层；4℃12000g离心15分钟；吸取上层水相，至一新管中；按照0.5毫升异丙醇/1毫升Trizol加入异丙醇，混匀后室温放置5～10分钟；4℃12000g离心10分钟，弃上清，可见RNA沉淀于管底；按照1毫升75％乙醇/1毫升Trizol加入75％乙醇，温和震荡离心管，悬浮沉淀；4℃7500g离心5分钟，弃上清，并重复一次；室温吹干沉淀，但不要过分干燥；加适量无RNA酶双蒸水，溶解RNA样品；测OD比值定量RNA浓度及验证RNA纯度；按照一定的体积比配制DNA I反应体系溶液，包括2微克总RNA，5×gDNA Eraser缓冲液，gDNA Eraser，无RNA酶蒸馏水；42℃反应2分钟后4℃保存；得到的反应液进一步进行反转录反应，加入PrimeScript RT Enzyme Mix I、RT Primer Mix、5×PrimeScript缓冲液以及无RNA酶蒸馏水，于37℃反应15分钟、85℃反应5秒，4℃保存备用。

5.根据权利要求2所述的内参基因的筛选方法，其特征在于：所述步骤(3)中定量PCR引物设计通过PerlPrimer v1.1.16、NCBI primer BLAST、文献和引物库进行基因引物设计，所引物扩增效率检验采用标准曲线法检验候选基因扩增引物的扩增效率，取一定量的模板cDNA，进行5个梯度稀释后，建立各个候选基因的标准曲线，根据斜率通过公式E＝10^-1/Slope计算出特定引物的扩增效率，选取扩增效率1.8～2.1之间的候选基因引物进行下一步定量复验。

6.根据权利要求2所述的内参基因的筛选方法，其特征在于：所述步骤(4)中定量PCR在肝癌细胞株中开展3次生物学重复的qRT-PCR复验，获取到不同细胞株中候选基因的C_t值，所述候选基因表达稳定性评估采用了四种不同的算法geNorm、NormFinder、DeltaCt和BestKeeper及其稳定性指数整合工具RefFinder对候选内参基因稳定性进行打分，并最终的整合结果；由于一些算法是全局依赖性的，即某个基因的稳定性得分会随着参与计算的其它基因的不同而改变，我们采用了迭代排除法逐次去掉最不稳定的一个基因，直至候选列表缩减到只剩最后两个基因为止；具体操作是：geNorm、NormFinder、DeltaCt和BestKeeper分别会对输入的候选基因有一个不稳定性得分，分数越高则表明该基因的表现越不稳定；我们将分数升序排列即可得到该轮评估中候选内参的稳定性排序，而RefFinder则将候选基因在四种算法中的排序数取几何平均作为其综合不稳定性得分；我们去掉该轮得分最高的基因，将剩下的基因按上述步骤重新计算不稳定性得分；如此循环处理，直至剩下无法区分稳定性差异的两个最稳定基因；除了用RefFinder整合法评估外，也在四种算法中分别单线采用迭代排除法得到评估结果以作参考。