[发明专利]一种胶原蛋白的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及胶原蛋白的提取工艺，具体涉及一种胶原蛋白的制备方法。

背景技术

胶原蛋白又叫胶原，是一种含糖蛋白质，在自然界分布广泛，主要分布在哺乳动物的结缔组织中，作为皮肤、骨骼、肌腱、韧带、血管的构成材料。胶原特有的空间结构赋予其优异的理化性质和生物活性、生物相容性、生物可降解性和低抗原性等，从而成为目前研究和应用最为广泛的一类结构蛋白，在食品、化妆品、组织工程和生物医学材料等领域得到了广泛应用。

正因胶原蛋白在化妆品、医药、食品、饲料等领域得到越来越广泛的应用，使得需求量逐年增大。从猪、牛等陆生动物皮和骨提取的方法。难以满足市场需求。从水生动物中提取胶原蛋白受到重视。鱼鳞鱼皮中含有丰富的胶原蛋白和各种矿物质，一般占鱼重的5％左右，极少得到利用，往往当成垃圾扔掉，不仅浪费资源，且污染环境。从鱼鳞鱼皮中提取胶原蛋白，可以充分利用鱼鳞皮废弃物，变废为宝。因此测定提取过程中胶原含量的变化对研究鱼鳞鱼皮的功能性及产品性能具有重要的意义。

胶原或胶原蛋白的定量分析有多种方法，对于已知是胶原或胶原蛋白的样品，凯氏定氮法是最可靠的，其次可用双缩脲法、紫外分光光度法、Folin-酚法和考马斯亮蓝G-250染色等。但对于未知是胶原或胶原蛋白的样品，以上方法则不太适合。胶原蛋白含量常规的测定方法是氯胺T氧化法，此法特异、 准确，但繁琐、耗时。

目前，国内外胶原蛋白提取方法主要有碱法，热水提取，盐法，酸法，酶法等。

其中，酸法、碱法和热水抽提法胶原溶出率很低，且酸法、碱法对环境污染严重，水抽提法得到的往往是胶原的变性产物，而酶法转移性强、破坏性小，能更好地获得活性胶原，但水解不够彻底。这些方法有的会造成胶原肽键水解，含羟基、巯基的氨基酸全部被破坏，使胶原蛋白变性；有的会导致大量的胶原蛋白流失。特别是鱼皮质材料不同，普通提取方法较难达到理想的提取效果，因此有必要对鱼皮胶原蛋白提取方法进行改进研究。

总的来说，现如今的胶原蛋白的提取方法大多存在胶原蛋白提取率低，或者工艺较复杂，提取时间较长、腥味较重、脂肪残存严重等问题。

因此，寻找一种合适的胶原蛋白的提取工艺，以此来适应于社会的需求，便成了一件亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题：针对目前胶原蛋白提取中胶原肽键被水解，羟基被破坏，胶原蛋白易变性的问题，提供了一种胶原蛋白的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明采用如下所述的技术方案是：

一种胶原蛋白的的制备方法，该制备方法包括如下步骤：

（1）挑取米曲霉菌溶于质量分数为0.9%生理盐水中，得到米曲霉菌悬液，将米曲霉菌悬液接种至发酵培养基中，培养，得发酵培养液，向发酵培养液中加入蒸馏水混合，得混合液，将混合液置于高效组织捣碎机捣碎，抽提1h，离心，取上清液A，得粗酶液，向粗酶液中加入硫酸铵溶液至沉淀析出，取沉淀加蒸馏水混合，得沉淀溶液，沉淀溶液透析24h，离心，取上清液B，干燥，得粗酶粉末；

（2）将前处理的驴皮匀浆液和粗酶粉末加入浓度为0.5mol/L柠檬酸水溶液混合均匀，得混合溶液，向混合溶液中加入叔丁基二苯基硅醚、苄基醚，磁力搅拌48h，过滤，得滤液，将滤液离心，取上清液，得胶原蛋白粗提取液；

（3）取胶原蛋白粗提取液溶于色谱甲醇中，氮气脱气，得到脱气后胶原蛋白粗提取液，将脱气后胶原蛋白粗提取液与体积分数为10%的Pd /C催化剂混合，得混合溶液A，搅拌，向混合溶液A中加入三氟醋酸（TFA），得混合溶液B，使用氢气保护，室温搅拌反应，反应结束，过滤，得滤液，取滤液甲醇洗涤，得去保护剂胶原蛋白溶液，干燥，得胶原蛋白粉末。

所述步骤（1）中米曲霉从自然发酵生产的豆酱中分离得到，胶原蛋白提取酶解所需酶发酵培养基的配方为按质量份数计，取麸皮、葡萄糖、水按质量比9：1：5混合均匀，121℃灭菌20min，即得。

所述步骤（1）中米曲霉与生理盐水的质量比为1：9，发酵培养液与蒸馏水的质量比为1：10。

所述步骤（2）中驴皮前处理：驴皮解冻，除去皮下脂肪，将驴皮剪成5mm×5mm的小块，放入放入质量分数为5%的NaCl溶液中浸泡24h后，得浸泡后驴皮，向浸泡后驴皮中加入浓度为0.5mol /L的柠檬酸溶液，浸泡后驴皮与柠檬酸溶液按质量比为1：10混合均匀，于4℃搅拌下溶胀12h，将溶胀后的驴皮匀浆液。