[发明专利]一种构建RIP3基因敲除小鼠的碱基序列、载体、方法及应用

说明书

本发明公开一种构建RIP3基因敲除小鼠的碱基序列、载体、方法及应用，通过CRISPR/Cas9系统靶向修饰RIP3基因的第3个外显子，使其发生序列缺失和移码突变，获得RIP3基因敲除小鼠模型，RIP3基因敲除小鼠模型可用于RIP3基因在结肠癌的发生、发展中的研究。

技术领域

本发明涉及RIP3基因敲除小鼠模型的构建方法及应用，具体的为一种构建RIP3基因敲除小鼠的碱基序列、载体、方法及应用。

背景技术

RIP3全称为受体相互作用丝氨酸-苏氨酸激酶3，共518个氨基酸，分子量为56.8kDa。在整个RIP3蛋白的518个氨基酸中，有两个功能结构域。N-末端包含一个RIPs家族都有的激酶结构域(21-287)，根据保守序列推断激酶结构域的活性中心为K50和D142。人源RIP3的激酶活性位点是Lys50，该位点对RIP3的激酶活性与ATP结合非常重要，如果该位点发生突变，其激酶活性会丧失。近年来，研究发现，RIP3参与肿瘤坏死因子TNF-α诱导的细胞程序性坏死，它是TNF-α的细胞凋亡与坏死不同死亡路径的关键转换分子。而由RIP3引发的下游信号通路与能量代谢相关的细胞程序性坏死，可能是机体在凋亡抑制下杀死病毒感染细胞、肿瘤细胞等异常细胞的重要保护机制。而且，已有研究发现，RIP3基因的变异体及其SNPs位点在非霍奇金淋巴瘤的发生发展中发挥重要作用。因此，对RIP3基因在肿瘤发生发展过程中的功能研究具有重要的医学应用价值。

发明内容

针对现有技术中的缺陷和不足，本发明的目的是提供一种构建RIP3基因敲除小鼠的碱基序列、载体及方法，为RIP3基因在结肠癌中生物学功能的研究提供小鼠模型。

为达到上述目的，本发明采取的技术方案包括：

一种构建RIP3基因敲除小鼠的碱基序列，该碱基序列为CAAGCCCTCTAACATTCTGC。

一种构建RIP3基因敲除小鼠的载体，该载体为连接有CAAGCCCTCTAACATTCTGC碱基序列的gRNA/Cas9表达载体。

具体的，该载体为在gRNA/Cas9表达载体U6启动子下游插入CAAGCCCTCTAACATTCTGC碱基序列的gRNA/Cas9表达载体。

更具体的，针对小鼠RIP3基因第3外显子设计gRNA序列，将具特异性结合功能的gRNA连接到gRNA/Cas9表达载体U6启动子下游，具有特异性结合功能的gRNA序列即为CAAGCCCTCTAACATTCTGC碱基序列。

一种构建RIP3基因敲除小鼠的方法，该方法包括将所述的碱基序列或所述的载体用于构建RIP3基因敲除小鼠。

具体的，该方法包括：针对小鼠RIP3基因第3外显子设计gRNA序列，将具有特异性结合功能的gRNA连接到gRNA/Cas9表达载体U6启动子下游得到连接有CAAGCCCTCTAACATTCTGC碱基序列的gRNA/Cas9表达载体，然后将连接有CAAGCCCTCTAACATTCTGC碱基序列的gRNA/Cas9表达载体注射到小鼠受精卵中产生RIP3基因敲除小鼠。

更具体的，产生RIP3基因敲除小鼠包括：将注射有连接有CAAGCCCTCTAACATTCTGC碱基序列的gRNA/Cas9表达载体的受精卵移植到代孕母鼠输卵管壶腹部后生长发育得到RIP3基因靶点处发生序列缺失的小鼠，将RIP3基因靶点处发生序列缺失的小鼠与野生型小鼠杂交繁育获得单一基因型的杂合子小鼠，单一基因型的杂合子小鼠之间杂交繁育获得RIP3基因靶点处发生序列缺失的纯合子小鼠，即为RIP3基因敲除小鼠。

更加详细的，包括：

(1)gRNA/Cas9表达载体构建：针对小鼠RIP3基因的第3外显子序列设计gRNA引物，包括gRNA正向引物和gRNA反向互补引物，将gRNA正向引物和gRNA反向互补引物退火合成的gRNA双链DNA连接到gRNA/Cas9表达载体U6启动子下游获得gRNA/Cas9表达载体；