[发明专利]一种构建RIP3基因敲除小鼠的碱基序列、载体、方法及应用有效
| 申请号： | 201710936098.5 | 申请日： | 2017-10-10 |
| 公开（公告）号： | CN108048463B | 公开（公告）日： | 2021-12-03 |
| 发明（设计）人： | 唐娟;王建超;陈志南 | 申请（专利权）人： | 中国人民解放军第四军医大学 |
| 主分类号： | C12N15/113 | 分类号： | C12N15/113;C12N15/85;A01K67/027 |
| 代理公司： | 西安恒泰知识产权代理事务所 61216 | 代理人： | 孙雅静 |
| 地址： | 710032 *** | 国省代码： | 陕西;61 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 构建 rip3 基因 小鼠 碱基 序列 载体 方法 应用 | ||
1.一种构建RIP3基因敲除小鼠的方法，其特征在于，该方法包括将连接有CAAGCCCTCTAACATTCTGC碱基序列的gRNA/Cas9表达载体用于构建RIP3基因敲除小鼠，包括：
(1)gRNA/Cas9表达载体构建：针对小鼠RIP3基因的第3外显子序列设计gRNA引物，包括gRNA正向引物和gRNA反向互补引物，将gRNA正向引物和gRNA反向互补引物退火合成gRNA双链DNA后连接到gRNA/Cas9表达载体U6启动子下游获得gRNA/Cas9表达载体；
(2)RIP3基因敲除小鼠模型的构建：将步骤(1)获得的gRNA/Cas9表达载体纯化后以1ng/ul的浓度显微注射到小鼠受精卵中，注射有gRNA/Cas9表达载体的小鼠受精卵移植给代孕母鼠，妊娠期满出生F0代RIP3基因敲除小鼠，再将F0代RIP3基因敲除小鼠与野生型小鼠杂交繁育得到RIP3基因敲除小鼠；
所述的gRNA正向引物为287F-CAAGCCCTCTAACATTCTGC；gRNA反向互补引物为287R-GCAGAATGTTAGAGGGCTTG。
2.如权利要求1所述的构建RIP3基因敲除小鼠的方法，其特征在于，该方法包括：针对小鼠RIP3基因第3外显子设计gRNA序列，将具有特异性结合功能的gRNA连接到gRNA/Cas9表达载体U6启动子下游得到连接有CAAGCCCTCTAACATTCTGC碱基序列的gRNA/Cas9表达载体，然后将连接有CAAGCCCTCTAACATTCTGC碱基序列的gRNA/Cas9表达载体注射到小鼠受精卵中产生RIP3基因敲除小鼠；
产生RIP3基因敲除小鼠包括：将注射有连接有CAAGCCCTCTAACATTCTGC碱基序列的gRNA/Cas9表达载体的受精卵移植到代孕母鼠输卵管壶腹部后，生长发育得到RIP3基因靶点处发生序列缺失的小鼠，将RIP3基因靶点处发生序列缺失的小鼠与野生型小鼠杂交繁育获得单一基因型的杂合子小鼠，单一基因型的杂合子小鼠之间杂交繁育获得RIP3基因靶点处发生序列缺失的纯合子小鼠，即为RIP3基因敲除小鼠。
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