[发明专利]三种重组糖化酶及其制备方法与应用

说明书

本发明通过将GATE(GenBank ID：AJ304803.1)和GAA1(GenBank ID:HQ537427.1)两种糖化酶基因的结构域重组及突变缺失，提供至少三种热稳定性好且酶活力高的重组糖化酶、制备方法与应用。本发明三种重组糖化酶的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示。本发明还提供了包括编码本发明糖化酶的核苷酸序列与表达载体连接而成的进行功能性表达的重组表达载体，以及包含有本发明重组表达载体的重组菌株及其后代。

技术领域

本发明属于酶的基因工程技术领域，具体涉及到由两种糖化酶结构域重组及突变获得的三种重组糖化酶及其制备方法与应用。

背景技术

糖化酶(EC.3.2.1.3.)，又称葡萄糖淀粉酶(Glucoamylase,GA)，是一种具有外切酶活性的单链酸性糖苷水解酶，是水解淀粉产生葡萄糖的主要酶类，它能把淀粉从非还原性末端水解α-1,4葡萄糖苷键产生葡萄糖，也能缓慢水解α-1,6葡萄糖苷键，转化为葡萄糖，同时也能水解糊精，糖原的非还原末端释放β-D-葡萄糖。糖化酶有Ⅰ型(GAⅠ)和Ⅱ型(GAⅡ)2种类型，Ⅰ型有三个功能区催化结构域(CD)、O-糖基化连接域(Linker)及结合域(SBD)组成，Ⅱ型缺少SBD区域，少数甚至缺少O-糖基化连接域。

糖化酶是最早实现工业化生产的一种重要酶类，并且迄今为止仍是用途最广、产量最大的酶制剂之一，被广泛地应用于食品、医药、发酵等工业，具有很高的应用价值，受到国内外学者的高度重视。我国对于糖化酶的需求量呈逐年上升趋势，糖化酶生产菌株产糖化酶的活力及耐受性有待进一步提高。

随着研究的深入，对其酶学结构、作用机理、结构-功能相关性等问题有了一定的了解。近年来，越来越多的学者在分子水平上通过定点突变等方法对糖化酶结构域进行了研究，分析糖化酶的结构与功能的关系。本发明利用两株产糖化酶菌种埃墨森篮状菌(Talaromyces emersonii)和黑曲霉(Aspergillus niger)。前者产糖化酶的比活力较高，但酶的热稳定性较差；后者的稳定性较好，但产糖化酶的比活力不高。

发明内容

本发明的目的是针对两株产糖化酶菌种埃墨森篮状菌(Talaromyces emersonii)和黑曲霉(Aspergillus niger)，前者产糖化酶的比活力较高，但酶的热稳定性较差；后者的稳定性较好，但产糖化酶的比活力不高的现有问题，通过将两种糖化酶基因的结构域重组及突变缺失，提供至少三种热稳定性较好且酶活力较高的重组糖化酶、制备方法与应用。

本发明技术方案概述如下：

由亲本埃墨森篮状菌糖化酶GATE(GenBank ID：AJ304803.1)和黑曲霉糖化酶GAA1(GenBank ID:HQ537427.1)出发，通过PCR技术分别扩增两种糖化酶基因的三个结构域CD、Linker和SBD，得到GATE和GAA1的六个结构域片段GATECD、GATEL、GATESBD、GAA1CD、GAA1L、GAA1SBD(核苷酸序列依次如SEQ ID NO：4～SEQ ID NO：9所示)；通过重叠PCR技术，将上述结构域重组，获得六种重组糖化酶GA1～GA6，筛选出其中酶活力较高的重组糖化酶GA1、GA2(氨基酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示)，再以重组糖化酶GA2为模板，通过PCR技术，扩增得到SBD区缺失突变的重组糖化酶GA7(氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示)，构建三种重组糖化酶的重组菌株，重组菌发酵高效表达重组糖化酶。

用于表达重组糖化酶的表达载体为pJ912-19；用于所述的表达载体转化的微生物宿主细胞为毕赤酵母X-33。

本发明重组糖化酶GA1、GA2或GA7的制备步骤概述如下：