[发明专利]循环肿瘤细胞捕获并进行全基因转录组检测的方法

说明书

本发明涉及循环肿瘤细胞(CTC)捕获并进行全基因转录组检测的方法。本发明揭示了一种捕获待测样品中CTC并对其进行单细胞全基因转录组测序并分析的方法。本发明的方法以简单的方式从待测样品中初步富集CTC后，通过运用微流控芯片进行单细胞捕获，制备油包水乳滴，进行高通量的单细胞全基因转录组建库，最后对转录组数据进行拆分以及对单个细胞基因转录组分析。本发明的方法可以实现CTC的数目、来源、突变、异质性等信息的分析。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种循环肿瘤细胞(CTC)捕获并进行全基因转录组检测的方法。

背景技术

实体肿瘤在生长过程中随着周围微环境的变化，一部分细胞从其上脱落，随着血液循环或是淋巴系统转移至身体各处，其中，经由血液循环的肿瘤细胞被称为循环肿瘤细胞(CTC，Circulating Tumor Cells)，在适宜条件下这些细胞进一步繁殖形成继发性肿瘤。近年来，随着肿瘤早筛概念的提出，CTC的早期发现及检测在肿瘤早期预防中发挥了重要作用。同时，CTC细胞的数量监测为癌症病人的治疗及预后评估提供了重要依据。因此，CTC的有效捕获及检测意义重大。然而，循环肿瘤细胞在病人外周血中含量很低，每毫升全血中仅有1～10个CTC，且个体异质性较高，如何有效地对CTC进行捕获及准确检测是当前面临的重大技术挑战。

近年来，关于循环肿瘤细胞的捕获和鉴定受到国内外广泛关注。一系列用于CTC富集及检测的方法相继报道。传统的CTC检测方法基本是基于对CTC细胞表面抗原的检测和定量。在这些方法中，抗体首先被附着在一个固体载体上，由于抗体-抗原的相互作用抗体和待检测细胞形成复合物。同样的原理，抗体可能先通过抗原-抗体反应和待检细胞形成复合物，然后再附着到一个固体载体上。其后，被抗体抓住的细胞被收集和标记以此来定量。比如免疫荧光技术检测循环肿瘤细胞。首先用附着于磁珠或微流体芯片的抗体将肿瘤细胞从血液中富集出来。然后用带有标记物、肿瘤细胞特异性的抗体标记肿瘤细胞并进行定量检测。一般来说，标记物包括放射性的同位素，染料，荧光素和酶(用于酶标反应)等。尽管基于抗原捕获的检测方法在临床上应用广泛，但是这些方法有许多不足之处：(1)检测灵敏度低，抗原酶标检测主要是通过对细胞抗原直接进行检测，这些方法的检出限有限，因此在细胞数量稀有时，灵敏度不够。(2)通量低，这些方法的通量受限于人工，因此不适用于大量筛查。(3)操作麻烦且人为误差大，传统方法的操作步骤繁复，人工要求高，因此不可避免有很多人为引入的实验误差，从而导致检测结果的可信性下降。(4)多重检测，对样本的多个抗原进行同时检测是临床诊断和治疗分型的重要指导指标，由于标记物的限制，不可能对样本的抗原进行大规模扫描。

现有的一系列用于CTC富集及检测的方法中，CTC的富集主要是利用细胞表面抗原的特异性结合来进行，包括阳性捕获法和阴性捕获法。阳性捕获法依赖于肿瘤细胞表面蛋白EpCAM的表达，其受到CTC组织来源及EpCAM表达水平的影响，对于EpCAM表达弱或不表达的肿瘤细胞，该方法无法进行有效捕获。阴性捕获法则利用CD54磁珠抗体吸附白细胞，去除白细胞后富集，该方法能回收所有种类CTC，但是纯度低，无法对CTC进行准确计数及分析。

因此，本领域亟待进行进一步的研究和改进，以期找到更为理想的富集、鉴定、分析循环肿瘤细胞的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供循环肿瘤细胞捕获并进行全基因转录组检测的方法。

在本发明的第一方面，提供肿瘤细胞进行转录组分析的方法，所述方法包括：

(1)富集循环肿瘤细胞，单细胞捕获并包装入乳滴，生成包含单细胞的油包水乳滴；

(2)对乳滴内单细胞建立RNA-seq文库，测序；

(3)进行转录组分析。

在本发明的一个优选例中，所述的捕获及检测循环肿瘤细胞的方法为非诊断性、非治疗性的方法。