[发明专利]一种鉴别葫芦尖孢镰刀菌的方法

说明书

本发明公开了一种鉴别葫芦尖孢镰刀菌的方法。ISSR标记引物UBC886在鉴别葫芦尖孢镰刀菌中的应用，UBC886的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。利用该引物对不同菌株进行PCR扩增，仅葫芦尖孢镰刀菌能扩增出1800bp的特异性条带。本发明的方法用于特异性的检测葫芦尖孢镰刀菌。该方法耗时短，特异性强，可以快速的鉴别出葫芦尖孢镰刀菌，实现对葫芦砧木根腐病的早期诊断。

技术领域

本发明属于生物技术领域，一种鉴别葫芦尖孢镰刀菌的方法。

背景技术

尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum Schi.)引起的农作物枯萎病是一种世界性分布的土传真菌病害，寄主范围广泛，可引起1000多种植物发病，造成严重减产，甚至绝收。尖孢镰刀菌种内致病菌株具有高度的寄主专化性，根据对不同寄主植物的专化性珂分为专化型，同一尖孢镰刀菌不同的专化型引起的发病程度完全不同，如尖孢镰刀菌西瓜专化型就不会浸染黄瓜，同样尖孢镰刀菌古巴专化型只会浸染香蕉而不会浸染花生作物。肖荣凤(肖荣凤，瓜类尖孢镰刀菌生理分化特性研究[D].福建农林大学，2007年)通过尖孢镰刀菌脂肪酸气相色谱典型的模式图谱及菌株脂肪酸峰值变化规律分析发现尖孢镰刀菌rDNA-ITS区序列难以区分菌株专化型。所供试的瓜类尖孢镰刀菌不同专化型菌株的ITS1和ITS2区间的同源性均为100％。

葫芦尖孢镰刀菌可以致葫芦砧木根腐病的发生，自2005年浙江省温岭市首次出现葫芦砧木根腐病，7.3hm2嫁接西瓜全部死亡(林燚等，浙江农业科学，2007，1:84-86)。随后，在河北、湖北等地嫁接西瓜田也发生了此类病害，致使西瓜产量和品质下降，造成经济损失。目前生产上对于尖孢镰刀菌引起的葫芦根腐病的鉴定与检测以实地观察植株的发病症状和免疫学检测为主。但是，以上鉴定方法要求经验性强，普通的工作人员不能进行准确判断，其次耗时长，达不到在侵染初期诊断的目的，不能满足生产需求。因此，对葫芦尖孢镰刀菌侵染初期进行检测和诊断，对防治葫芦根腐病害具有十分重要的指导意义。

随着生物技术的发展，分子检测技术如RFLP(张宝俊等，西北农林科技大学学报(自然科学版)，2005，33：88-90)、RAPD(廖林凤等，植物病理学报，2009，39：353-361)以及SCAR(刘景梅等，植物病理学报，2006，36：28-34)等逐渐应用于病原菌检测。但是这些标记技术在使用中存在不足，如RFLP技术在检测中需要进行限制性内切酶切割，工作量大，耗时长，不适合大批量样品的检测分析。RAPD技术在分析中较易受到各种因素的影响，实验的稳定性和重复性较差。此外，基于菌株特异性引物也已成功建立了香蕉(李敏慧等，中国农业科学，2012,45:3971-3979)、甘蓝(张吉祥等，植物病理学报，2014,44:586-594)等枯萎病菌的分子鉴定技术。但是这种方法是在基因组测序的基础上实现的，不能满足一般实验室的需求。

ISSR(inter-simple sequence repeat)标记采用17～22个碱基的重复锚定引物扩增重复序列之间的片段。结合了RAPD和SSR的优点，具有操作简单、多态性丰富、重复性强、稳定性高等优点。已被广泛应用于品种鉴定、多样性分析、指纹图谱的构建等研究中。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供ISSR标记引物UBC886在鉴别葫芦尖孢镰刀菌中的应用。

本发明的另一目的是提供一种用于鉴别葫芦尖孢镰刀菌类型的方法。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

ISSR标记引物UBC886在鉴别葫芦尖孢镰刀菌中的应用，所述ISSR标记引物UBC886的核苷酸序列为5’-vdvctc tct ctc tct ct-3’(SEQ ID NO.1)所示。

ISSR标记引物UBC886在制备鉴别葫芦尖孢镰刀菌的试剂中的应用，所述ISSR标记引物UBC886的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。