[发明专利]一种空肠弯曲菌的活菌定量检测引物及方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，更具体地，涉及一种空肠弯曲菌的活菌定量检测引物及方法。

背景技术

空肠弯曲菌是鸡群中较为常见的人畜共患致病菌，且流行趋势呈逐年递增，不仅对我国的畜禽养殖业造成了严重的危害，而且在一定程度上还会导致家禽产品及食品的污染，对人类和动物的健康造成了巨大的威胁，危害公共卫生安全。

因此，调查了解该病原菌对日常生活中禽肉产品的污染程度，对控制食品中空肠弯曲菌的污染，以及减少人类食源性疾病的发生显得尤为重要。但目前为止，病原菌的定量检测以传统的平板活菌计数为主，操作繁琐、耗时费力，且存在由于病原菌进入可存活但不可培养(VBNC)状态所导致的漏检，而单纯采用MPN法(Most Probable Number，最大可能数法)则需要通过生化实验进行进一步鉴定，同样操作繁琐。

在分子生物学飞速发展的今天，荧光定量PCR也被用于微生物的定量检测，它具有快速简单、特异性强和敏感性高等特点。中国专利公开号105420404 A公开了一种鉴别空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌双重PCR引物及其鉴别方法，以空肠弯曲杆菌特有的hipO靶基因设计引物，取样本基因组DNA进行PCR扩增，当电泳检测在653bp和313bp位置有两条扩增条带表示样品为阳性，鉴别出样品中含有空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌。但该方法只能对反应体系中模板DNA进行定量，不能鉴别污染食品中死活菌体，无法准确测出污染食品的活菌量。

发明内容

针对上述现有技术中的问题，本发明旨在将MPN法和PCR技术相结合，提供一种空肠弯曲菌的活菌定量检测引物，并建立针对空肠弯曲菌的MPN-PCR快速定量检测方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案予以实现的。

一种用于空肠弯曲菌的活菌定量检测引物，依据空肠弯曲菌的马尿酸酶hipO基因设计的一对特异性PCR检测引物(如序列表SEQ ID NO.1～2所示)：

SEQ ID NO.1：HIP-F1 GAAGAGGGTTTGGGTGGTG；

SEQ ID NO.2：HIP-R1 AGCTAGCTTCGCATAATAACTTG。

上述引物进行了特异性检测，具体方法为：

取大肠杆菌菌液、产气荚膜梭菌菌液、空肠弯曲菌菌液、沙门氏菌菌液提取细菌DNA做模板，用上述引物进行PCR扩增，对引物进行特异性检测。反应体系为25μL，包括：2×EsTaq MasterMix 10μL，模板2.5μL，上、下游引物各1μL，灭菌双蒸水10.5μL，混匀。PCR扩增条件为：94℃5min，94℃30s，60℃30s，72℃1min，进行30个循环，72℃再延伸10min。同时以双蒸灭菌水为模板，设为阴性对照进行同条件扩增。实验结果确定上述引物具有检测空肠弯曲菌的特异性。

一种空肠弯曲菌的活菌定量检测方法，包括如下步骤：

S1.禽肉前处理：将采集的肉样加培养液制成质量体积比为1:9的匀浆液，将所述匀浆液进行5个连续梯度的10倍稀释，在微需氧环境下进行增菌培养；

S2.PCR反应：将上述增菌培养的样品，离心弃上清，用双蒸灭菌水重悬沉淀，水浴煮沸5min后冰浴5min，离心，取上清作为PCR模板；取PCR模板5μL，序列表SEQ ID NO.1～2所述的上、下游引物各1μL，2×Es Taq MasterMix 10μL，灭菌双蒸水8μL，混匀，进行PCR扩增；

S3.PCR产物鉴定：PCR扩增结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，观察，735bp处有条带即为阳性，拍照并分析试验结果；

S4.计算样品中活菌含量：根据PCR鉴定结果，确定空肠弯曲菌阳性的试管数，按照MPN法稀释度选择原则，选择三个连续稀释度，查MPN检索表，报告每g或每mL样品中的值。

优选地，步骤S1所述的增菌培养条件为在42℃培养48h。

优选地，步骤S2所述的2×Es Taq MasterMix包括：Es Taq DNA Polymerase，2×Es Taq PCR Buffer，3mM MgCl₂，400μM dNTPmix。

优选地，步骤S2所述的PCR扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，进行30个循环，72℃再延伸10min。

优选地，步骤S2所述的离心条件均为12000rpm离心5min。

优选地，步骤S3所述的凝胶电泳条件为120V电压电泳30min。