[发明专利]一种空肠弯曲菌的活菌定量检测引物及方法

权利要求书

1.一种空肠弯曲菌的活菌定量检测引物，其特征在于，依据空肠弯曲菌的马尿酸酶 hipO基因设计的一对特异性PCR检测引物：

HIP-F1 GAAGAGGGTTTGGGTGGTG；

HIP-R1 AGCTAGCTTCGCATAATAACTTG。

2.一种空肠弯曲菌的活菌定量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1. 禽肉前处理：将采集的肉样加培养液制成质量体积比为1:9的匀浆液，将所述匀浆液进行5个连续梯度的10倍稀释，在微需氧环境下进行增菌培养；

S2. PCR反应：将上述增菌培养的样品，离心弃上清，用双蒸灭菌水重悬沉淀，水浴煮沸5min后冰浴5min，离心，取上清作为PCR模板；取PCR模板5 μL，权利要求1所述的上、下游引物各1 μL，2×Es Taq MasterMix 10 μL，灭菌双蒸水8 μL，混匀，进行PCR扩增；

S3. PCR产物鉴定：PCR扩增结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，观察，735bp处有条带即为阳性，拍照并分析试验结果；

S4. 计算样品中活菌含量：根据PCR鉴定结果，确定空肠弯曲菌阳性的试管数，按照MPN法稀释度选择原则，选择三个连续稀释度，查MPN检索表，报告每g或每mL样品中的值。

3.根据权利要求2所述的一种空肠弯曲菌的活菌定量检测方法，其特征在于，步骤S1所述的增菌培养条件为在42℃培养48h。

4.根据权利要求2所述的一种空肠弯曲菌的活菌定量检测方法，其特征在于，步骤S2所述的2×Es Taq MasterMix包括：Es Taq DNA Polymerase，2×Es Taq PCR Buffer，3 mM MgCl₂，400 μM dNTPmix。

5.根据权利要求2所述的一种空肠弯曲菌的活菌定量检测方法，其特征在于，步骤S2所述的PCR扩增条件为：94 ℃预变性5 min，94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，进行30个循环，72℃再延伸10 min。

6.根据权利要求2所述的一种空肠弯曲菌的活菌定量检测方法，其特征在于，步骤S2所述的离心条件均为12000rpm离心5min。

7.根据权利要求2所述的一种空肠弯曲菌的活菌定量检测方法，其特征在于，步骤S3所述的凝胶电泳条件为120 V 电压电泳 30 min。

8.根据权利要求2~7任一项所述的一种空肠弯曲菌的活菌定量检测方法，其特征在于，所述的禽肉为鸡肉。