[发明专利]一种用于检测布鲁氏杆菌病IgM抗体的ELISA试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种ELISA试剂盒及其应用，特别涉及一种用于检测布鲁氏杆菌病IgM抗体的ELISA试剂盒及其应用。本发明属于医药技术领域。

背景技术

布鲁氏杆菌(Brucella Blues)是革兰氏阴性胞内寄生菌，无鞭毛、质粒，无荚膜。其根据宿主和致病性的不同可分为猪(Bsuis)、牛(B.abortus)、羊(B.melitensis)、沙林鼠(B.neotomae)、绵羊(B.ovis)、犬(B.canis)布氏杆菌6种19型，其中猪、牛、羊3种16型可通过气溶胶感染人类，寄生于单核巨噬细胞，破坏机体的免疫系统，是世界范围内广泛流行的亚种。由布鲁氏杆菌引起的疾病统称为布鲁氏杆菌病，可感染多种动物，导致母畜早产、流产甚至不孕不育，公畜引发睾丸炎、机体发育不良等症状。人类感染，可引起波浪热、关节疼痛、睾丸和肝脾肿大等生理系统的病变。它是世界上最为普遍的人畜共患病之一。

当前布鲁氏杆菌的检测方法有多种，布鲁氏杆菌的分离培养是诊断布鲁氏杆菌病的“金标准”，但分离率低、耗时长、生物安全要求较高、不适用于广泛应用；PCR方法和基因探针方法特异性强、敏感性高，但基因组DNA的提取也涉及到生物安全问题；虎红平板凝集试验操作简单、价格便食、操作快速，但易出现假阳性；试管凝集试验和补体结合试验是我国诊断布鲁氏杆菌病的法定确诊方法，但操作相对复杂、方法繁琐费事、反应时间长、不适用于现场操作，而酶联免疫吸附试验是20世纪70年代发展起来的一种新型布鲁氏杆菌病快速检测技术，该方法简单、快速、敏感性高、特异性高、结果易于判定、易于标准化、可实现高通量检测，具有良好的应用前景。2004年，竞争ELISA(rELISA)被世界动物卫生组织(OIE)列为诊断和消灭牛布鲁氏杆菌病的推荐方法。

病原感染机体后，产生的抗体主要为IgG、IgM、IgA三种，IgG是血清中浓度最大的一类球蛋白，约占免疫球蛋白含量的70～80％。机体受到抗原初次刺激后，其产生时间仅次于IgM，在抗体介导的抗感染免疫中起主要作用。目前市面的布鲁氏杆菌ELISA检测试剂盒主要检测的就是布鲁氏杆菌阳性血清中的IgG。

IgM由5个球蛋白单位组成的五聚体，在血清中的含量仅次于IgG，是体内最大的球蛋白。抗原初次刺激机体后，IgM出现最早，主要分布在血管内，可以通过激活补体发挥溶菌、溶细胞及中和病毒的作用。因其是五聚体，免疫作用很强，是IgG的100倍，但由于含量仅为IgG的1/10，且持续时间短，所以检测难度较大。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种通过检测血清中IgM抗体含量，进而用于布鲁氏杆菌病的早期诊断及急性感染检测的ELISA试剂盒。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明的一种用于检测布鲁氏杆菌病IgM抗体的ELISA试剂盒，包括布鲁氏杆菌抗原包被的微孔板、HRP标记的布鲁氏杆菌抗原、阴性对照品、阳性对照品、显色剂A、显色剂B、终止液以及浓缩洗涤液。

在本发明中，优选的，所述的布鲁氏杆菌抗原包被的微孔板按照以下方法制备得到：

(1)布鲁氏杆菌抗原的制备

在生物安全环境条件下无菌操作，将布鲁氏杆菌接种于TSB液体培养基中，密封器皿口，37℃培养至对数期收菌，将菌液灭活后，离心收集沉淀，将沉淀重悬于PBS溶液中，超声破碎处理，离心，收集上清，即为布鲁氏杆菌抗原；

(2)用pH9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲液将布鲁氏杆菌抗原稀释成4.0μg/mL，用微量移液器将稀释好的抗原加入到微孔板各孔内，每孔100μL，将微孔板置于4℃过夜，弃去微孔板孔内的包被液，加入PBST洗涤液，室温下振荡洗涤，甩掉洗涤液，用吸水纸吸干并驱除孔内气泡，同法重复洗涤3次，将微孔板甩干，之后每孔加入封闭剂，37℃反应60min，弃去孔内封闭液，用上述方法洗涤3次，排干反应板，得到布鲁氏杆菌抗原包被的微孔板，用铝箔袋真空包装，4℃保存备用。

其中，优选的，所述的PBST洗涤液为含有0.05v/v％Tween20的0.01mol/L PBS，pH 7.4。

其中，优选的，所述的封闭剂为含0.5w/w％明胶以及5w/w％蔗糖PBST溶液。

在本发明中，优选的，所述的阴性对照品为布鲁氏杆菌阴性的动物血清，所述的阳性对照品为布鲁氏杆菌阳性的动物血清。

在本发明中，优选的，所述的显色剂A、显色剂B按照以下方法制配制：