[发明专利]一种用于检测布鲁氏杆菌病IgM抗体的ELISA试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种用于检测布鲁氏杆菌病IgM抗体的ELISA试剂盒，其特征在于包括布鲁氏杆菌抗原包被的微孔板、HRP标记的布鲁氏杆菌抗原、阴性对照品、阳性对照品、显色剂A、显色剂B、终止液以及浓缩洗涤液。

2.如权利要求1所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述的布鲁氏杆菌抗原包被的微孔板按照以下方法制备得到：

(1)布鲁氏杆菌抗原的制备

在生物安全环境条件下无菌操作，将布鲁氏杆菌接种于TSB液体培养基中，密封器皿口，37℃培养至对数期收菌，将菌液灭活后，离心收集沉淀，将沉淀重悬于PBS溶液中，超声破碎处理，离心，收集上清，即为布鲁氏杆菌抗原；

(2)用pH9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲液将布鲁氏杆菌抗原稀释成4.0μg/mL，用微量移液器将稀释好的抗原加入到微孔板各孔内，每孔100μL，将微孔板置于4℃过夜，弃去微孔板孔内的包被液，加入PBST洗涤液，室温下振荡洗涤，甩掉洗涤液，用吸水纸吸干并驱除孔内气泡，同法重复洗涤3次，将微孔板甩干，之后每孔加入封闭剂，37℃反应60min，弃去孔内封闭液，用上述方法洗涤3次，排干反应板，得到布鲁氏杆菌抗原包被的微孔板，用铝箔袋真空包装，4℃保存备用。

3.如权利要求2所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述的PBST洗涤液为含有0.05v/v％Tween20的0.01mol/L PBS，pH 7.4。

4.如权利要求2所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述的封闭剂为含0.5w/w％明胶以及5w/w％蔗糖PBST溶液。

5.如权利要求1所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述的阴性对照品为布鲁氏杆菌阴性的动物血清，所述的阳性对照品为布鲁氏杆菌阳性的动物血清。

6.如权利要求1所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述的显色剂A、显色剂B按照以下方法制配制：

显色剂A溶液：称取EDTA-Na 0.2g，柠檬酸0.95g，甘油50ml，含有10mg/ml TMB的DMSO溶液0.2g，去离子水500ml，混合均匀；

显色剂B溶液：称取醋酸钠13.6g，柠檬酸1.6g，30w/w％H₂O₂ 0.3ml，去离子水500ml，混合均匀。

7.如权利要求1所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述的终止液为6.9v/v％的硫酸水溶液。

8.如权利要求1所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述的浓缩洗涤液按照以下方法制备：

称取氯化钠200g，氯化钾5g，十二水磷酸氢二钠72.5g，磷酸二氢钾5g和12.5ml吐温-20，加无离子水至1000ml，调节pH值为7.4。